蛋白质组学

GST融合蛋白纯化方法

GST融合蛋白纯化方法

1 目的片段接入pGEX载体;

2 涂板,挑单克隆,摇菌至OD600≈1.0,加入IPTG(终浓度1 mM)诱导6-8 h;

3 收菌,每升菌液约以50 mL PBS重悬,加入1%Triton X-100(v/v),1%β-巯基乙醇(v/v),PMSF(终浓度1 mM);

以下步骤均在冰上操作:

4 超声破碎菌体,15000 g,10min离心取上清,在上清中加入适量GST-beads,轻轻晃动令其吸附蛋白1 h;

5 2000 g,3min离心弃上清;

6 加入至少10倍体积PBS,轻摇至beads悬浮于溶液中,2000 g,3 min离心弃上清;

7 重复步骤6 两次;

8 加入1 mL GST Elution Buffer,轻摇10 min;

9 2000 g,3 min离心,收集上清;

10 重复步骤8-9至少两次;

11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,Bradford法检测蛋白浓度;

12 将蛋白置于-20℃保存。

P.S. 大量提取前应取少量菌液,改变IPTG浓度,诱导温度,诱导时间等,以确定蛋白表达的最适条件。

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