蛋白质组学

蛋白质相互作用

免疫共沉淀和亲和层析共分离:

免疫共沉淀是证明蛋白质-蛋白质相互作用的最直接最经典和最有效的方法,如蛋白A能与B相互作用结合成异源二聚体,无论用抗A或抗B的抗体或与A或B的亲和物偶联的agarose小珠都能把A和B沉淀下来。因此广泛用于蛋白质相互作用研究。

常用的小珠:

GST-Agarose(不需要抗体)

ProteinA-Agarose(用时需加抗体)

基本方法:

1.表达蛋白质A

2.蛋白质A与亲和小珠结合

3.用结合有蛋白质A的亲和小珠调取细胞破碎液中蛋白质B

4.离心、洗涤亲和小珠若干次

5.处理亲和小珠使蛋白质A、B解吸附(可以直接用SDS-PAGE上样BUFFER煮)

酵母双杂交系统

基本原理,以酵母S.cerevisiae的转录因子GAL4系统为例

GAL4有两个结构上互相分开,功能上相互独立的结构域。

N 端1-147aa与DNA结合(DNA binding domain,BD)。

C端768-881aa能激活转录(Activation Domain,AD)。

BD+AD—能激活GAL4效应基因的上游激活序列(UAS)。

把N和C分开分别构建成两种表达质粒。如把Gal4的N端和诱饵蛋白(研究的目标蛋白A)融合表达,把细胞cDNA和C端融合表达,cDNA编码的蛋白x如能和A互相作用,就能把Gal4N端C端和N端联系在一起,就可以激活UAS下游的基因表达。

半乳糖苷酶(Laz)基因克隆到URA3的下游。

在x-Gal的存在下酵母菌落成蓝色(Fields)

酵母GAL4基因缺失;GAL80基因缺失(GAL4的负调控因子)

方法略

假阳性多,因此还必须再用免疫共沉淀等直接证据证明

发展:哺乳动物双杂交系统、二倍体双杂交系统、酵母单杂交系统、细菌双杂交系统、酵母三杂交系统

FAR WESTERN

Western blot 是免疫印记,而Far western 是蛋白质铺盖技术,两者其实在本质上是相似的,只是免疫印记是直接用抗体去检测抗原,常用于蛋白质定性;而Far western则是用标记的蛋白(125I或荧光)去probe与之相互作用的蛋白,或再用抗这种蛋白的抗体显示这种蛋白的结合位置,用于研究蛋白质的相互作用。

基本步骤:

1.表达和提纯获得蛋白A,并作荧光或放射性标记,或制备抗A抗体

2.细胞总蛋白SDS-PAGE(一起染色,另一块转膜)

3.电转膜

4.封闭

5.加入蛋白A,如A带标记,洗膜后直接显影;如未标记,可加抗A抗体再加二抗或标记的蛋白A。

优点:简单、经济

缺点:SDS-PAGE影响蛋白质构象,可能影响相互作用

表面等离子共振(SPR)法原理:

SPR法是生物科学、物理学和计算科学结合的方法,在玻璃表面镀上一层金薄膜,再把目标蛋白通过氨基共价偶联在金膜表面制成传感芯片。当一束偏振光照射到传感芯片的金膜时会引起金属中的电子共振,而导致反射光会在一定角度内大大减弱,其中反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随着金膜表面通过的液相的折射率的改变而改变,而折射率的改变又与结合在金膜表面的生物大分子的质量成正比,每结合1ng/mm2折射率的变化相当于1000RU(共振单位),如果通过的液相中有能与膜表面偶联的靶蛋白相互作用而结合的蛋白质或其它化学物,就使结合在金膜表面的生物大分子质量增加,检测的共振单位(RU)也增加。通过光检测单元检测反射光的变化,经数据处理系统处理后,获得实时传感图。

特点:

1.灵敏度,所需样品少(20μl就可分析)

2.可以同时确定互相作用动力学参数Ka、Kd值

3.可以测蛋白质-蛋白质互相作用,也可测蛋白质与共它分子互相作用(小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖、类脂、噬菌体、病毒和细胞)

4可以回收结合的蛋白进一步研究和鉴定(如质谱分析)SPR分析的条件控制:样品制备:样品的PH、离子强度,对相互作用有显著影响,一般PH范围在6.8-7.8之间,低离子强度,样品中蛋白质浓度变化影响不大,样品体积20-50μl。温度:一般25℃+5℃,温度高于30℃对相互作用有影响进流速:全程流速恒定,进样速度不宜过快,保证接触时间,一般进样速度5-10μl/分所需仪器:生物分子相互作用仪(如Biocore X型)分析软件:如BLAevaluation(Version3.1)软件。

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