蛋白质组学

核蛋白的提取方法

柱式法 Minute TM 胞质胞核分离试剂盒操作方法:

A. 悬浮细胞样品(包括植物,细菌,酵母和真菌制备的原生质体)

1.500Xg,3 分钟低速离心收集细胞,用预冷的 PBS 清洗一次

2. 将细胞转移到 1.5 ml 离心管中,3000 rpm 离心 1-5 分钟,弃去上清。

3. 按表格 1 加入适量的胞浆提取缓冲液(请注意样品及裂解液的比例,以达到最佳效果), 涡旋大力震荡 15 秒, 冰上孵育 5 分钟, 混匀. 接转胞质胞核分离步骤。

B. 贴壁细胞

1. 贴壁细胞生长至融合度 90-100%,将预冷的 PBS 直接加入细胞培养板,培养皿或培养瓶中清洗细胞两次,吸去上清。

2. 按表格 2 将适量的胞浆提取缓冲液均匀的加入整个器皿表面,冰上静置 5 分钟。用吸头吹打几次后转移到预冷的 1.5 ml 离心管中。涡旋大力震荡 15 秒。接转胞质胞核分离步骤。(请注意样品及裂解液的比例,如浓度较低请减少裂解液使用量)

C.组织样品

1. 称重适量组织样品,放入预冷的 1.5 ml 离心管中。

2. 用预冷的 PBS 清洗组织样品一次。3000rpm 离心 1 分钟,弃去上清,尽可能的使沉淀干燥。

3. 按表格 3 加入适量胞浆提取缓冲液,用微型管杵或微粉碎机匀浆,去除没有完全匀浆的组织碎片。接转胞质胞核分离步骤。

胞质胞核分离步骤

1. 4oC,最高速 (14000-16000 rpm) 离心 5 分钟

2. 将上清液(上清为胞浆组份)转移到一个新的预冷的 1.5 ml 离心管中。将沉淀(可选优化:用 0.5 ml 预冷 PBS 重悬,10000 rpm,离心 3-5 分钟清洗沉淀可以减少胞浆蛋白污染)中加入适量的胞核提取缓冲液,涡旋大力震荡 15 秒,冰上孵育 1 分钟。

然后重复震荡 15 秒,冰上孵育 1 分钟四次。(如核蛋白提取浓度低,可适当延长每次孵育及震荡时间)

3. 迅速将核提取物转入到预冷的离心管套管中,14000-16000 rpm,离心 30 秒。弃掉离心管柱。将核蛋白储存于-80℃。一般产量 1.5-2.5 mg/ml。

(0)

热评文章

发表评论