蛋白质组学

酵母双杂交实验操作步骤大全

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最近在做龙须菜高温胁迫表达cDNA文库的构建,选择的是CaM做诱饵质粒构建表达载体pGBKT-CaM,利用SMART技术将重组质粒转化到酵母菌 Y187中,搜集了部分资料找到了一份比较全的酵母双杂交实验操作步骤。

一.酵母双杂交系统的原理

酵母的转录激活因子GAL4由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成,N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD),C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。BD可以和上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)结合,而AD则能激活UAS下游的基因进行转录。

但是,单独的BD或AD不能激活基因转录,它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。

酵母双杂交系统主要利用酵母的GAL4的这个特性通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋白质的相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因敏感地检测到。

酵母双杂交技术不仅应用于哺乳动物蛋白质之间的相互作用研究,还可以用来研究高等植物 蛋白质之间的相互作用。

二.酵母双杂交系统的组成:

1. 载体质粒 :pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库

2. 酵母菌株:EGY48、EGY48(p8op-LacZ)、YM4271(EGY48的伴侣菌株)

3. 大肠杆菌菌株:E.coli KC8株

4. 对照:

pLexA-53,pB42AD-T 阳性对照

pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕 阳性对照

pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒

5. 引物:

pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

三.酵母双杂交系统的实验步骤:

1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株,用培养基SD/-Ura筛选。

2. 同时构建DNA文库,并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。

3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X,作为钓饵(bait)。

4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株,用SD/-His/-Ura筛选;并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性,以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。

转化质粒 选择培养基 克隆生长情况 说 明

(含有Gal/Raf)

pLexA-Pos SD/-His,-Ura 蓝 阳性对照

pLexA SD/-His, -Ura 白 阴性对照

PlexA-X SD/-His, -Ura 白 没有直接激活活性

PlexA-X SD/-His, -Ura 蓝 具有直接激活活性

PlexA-X SD/-His, -Ura 菌落不能生长 酵母细胞毒性

能够自动激活报告基因,则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组,

1.4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用减少。

4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因,但对酵母宿主细胞有毒性,则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。

5. 如果pLexA-X不自动激活报告基因,也不具有毒性,则可以在纯化的文库DNA同时、顺序转化酵母细胞,并检测质粒转化效率。

转 化 质 粒 SD固体培养基 LacZ表型

对照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝

对照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝

+pB42AD-T

实 验 pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测

+pB42AD-文库

5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子,并扩增,使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。

5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu,观察LacZ及Leu报告基因的表达情形,蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性,说明Leu虽有表达,但b-半乳糖苷酶无表达。

5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的,是为了尽可能消除实验的假阳性误差,譬如:AD融合蛋白不与目标蛋白结合,而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同,出现上述假阳性的几率就大大减少了。

5-4. 将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种,尽可能分离克隆中的多种文库质粒。

6. 阳性克隆的筛选

6-1. 随机选取50个阳性克隆,扩增、抽提酵母质粒,电转化E.coliKC8宿主菌,抽提大肠杆菌中的质粒,酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。

6-2. 如果重复的插入序列较多,可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列,再转化新的宿主细胞,检测是否仍为阳性克隆。

7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆

7-1. 将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基,培养1-2天,含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中,将以10%-20%左右的频率随机丢失。

7-2. 将上述克隆,转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura,30°C孵育2-3天。

7-3. 再挑取生长的单克隆,转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中,筛选His表型缺陷的克隆,即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。

7-4. 将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura,以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达,弃去阳性克隆,保留阴性克隆。

8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆

如下表所示,在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA,通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。

质粒1

(in YM4271) 质粒2

(in EGY48) LacZ表型 Leu表型

pLexA pB42AD 白 不能生长

pLexA-靶DNA pB42AD 白 不能生长

pLexA pB42AD-文库 白 不能生长

pLexA-靶DNA pB42AD-文库 蓝 真 阳 性

pLexA-Lam pB42AD-文库 白 不能生长

9. 阳性克隆的进一步筛选和确证

9-1. 扩增初步确定的阳性克隆,提取酵母DNA。它既含有酵母基因组DNA,也含有3种转化的质粒DNA。

9-2. 将上述DNA电转化E.coli KC8。由于在大肠杆菌中,具有不同复制起始调控序列的质粒不相容;同时利用营养缺陷型筛选。因此,在M9/SD/-Trp培养基上,只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长,将其扩增、并提取质粒DNA,酶切鉴定。

9-3. 用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中,先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增,并与后面的诱导板形成对照,说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关,再确证LacZ、Leu报告基因的表达。

9-4. 扩增与靶DNA相互作用的文库DNA,进行序列分析及进一步的结构、功能研究。

10. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究

10-1. 用不同的双杂交系统验证

10-1-1. 将载体 pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。

10-1-2. 选择不同的双杂交系统,如:以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。

10-1-3. 将文库质粒移码突变后,再与靶质粒作用,报告基因是否仍能被激活。

10-1-4. 去除或突变特定结合位点,定量检测b-半乳糖苷酶水平,比较作用强度变化。

10-2. 用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列,证明其编码区域。

10-3. 用其它的检测方法,如:亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。

10-4. 进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系

四.酵母双杂交系统的应用

可研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白—蛋白相互作用中起关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。相信随着分子生物学技术的发展与推广,酵母双杂交技术在今后的蛋白质组学研究中将发挥更大的作用。

心得体会:酵母双杂交技术主要是用于研究蛋白质之间的相互作用,核心关键步骤是酵母细胞的培养,它关系到酵母细胞的浓度和生长状态,一定要严格控制酵母细胞的培养时间。

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