蛋白质组学

膜蛋白提取方法

膜蛋白具有许多重要的细胞功能,对生物体存在至关重要。他们具有超过 60% 的药物靶点,占细胞总蛋白的 20%-30%。膜蛋白包括完整的膜蛋白,跨膜蛋白和外周膜蛋白。

膜蛋白或者附着在脂质双分子层上或者通过疏水,离子或其他非共价与膜周边的完整蛋白结合。

使用表面活性剂进行质膜蛋白分离提取效率不高,还有可能破坏蛋白质 - 蛋白质相互作用,改变膜蛋白的拓扑结构。

在一些下游应用中,例如膜蛋白 IP,Co-IP,酶检测,质谱分析实验,使用无表面活性剂的方法分离质膜蛋白远远好过使用表面活性剂的方法。多年来,使用无表面活性剂方法提取质膜蛋白大致可以分为以下三类方法:

A. 传统的蔗糖梯度离心(SGU):传统的蔗糖梯度离心法自上世纪 60-70 年代开发,至今仍被许多实验室用于质膜蛋白提取,蔗糖梯度离心可以将细胞蛋白分离成不同的组分和高度浓缩的膜蛋白。这种传统的方法需要大量的起始材料,操作过程复杂耗时。

B. 双水相亲和性分离:此方法的特点是大多数的亲水性聚合物对在水溶液中是不相容的,产生两个共存相,相互平衡。利用这个性质可以分离许多生物分子包括膜蛋白。该方法相对简单,快速,但是所需的起始细胞数相对较高,且产量相对较低。

C. 离心管柱法:使用离心管柱分离技术起始材料仅需 2*107 个细胞,即可将细胞 / 组织分离为细胞浆,细胞核,细胞器和质膜组分。

离心管柱带有特定孔径和表面性质,当细胞通过离心管柱,细胞膜被破裂分离出完整的细胞核,随后通过差速离心和密度离心分离出质膜蛋白,无需使用超高速离心。可以应用于 SDS-PAGE、immunoblottings、ELISA、IP、Co-IP、MS、2-D、酶活性检测等其他应用。

离心管柱法膜蛋白提取操作方法:

1. 将离心管柱及接收管套管放置冰上预冷。

2. 细胞样品,低速离心(500-600Xg,5 分钟)收集 1-50 X 106 个细胞。接转 3a 步骤。组织样品,接转 3b 步骤。(贴壁细胞样品建议使用细胞刮刀收集,尽量不使用胰酶消化) 注意:从细胞样品中分离质膜蛋白,建议细胞量为 20-50 X 106 个细胞。

3a. 用预冷的 PBS 清洗一次细胞。去除上清,在 Buffer A 中重悬细胞(起始细胞数小于 5X 106 加入 200ul Buffer A,起始细胞数大于 5X 106 加入 500ul Buffer A)。冰上孵育 5-10 分钟。涡旋大力震荡 10-30 秒。迅速将细胞悬液转入离心管柱中。接转步骤 4.

3b. 组织样品,将新鲜组织(10-30mg)或冷冻组织(20-30mg)放置于离心管柱上。加入 200ul Buffer A,用塑料棒反复扭转研磨组织 1 分钟(注意:如果你的样品是骨骼或是心肌,建议在研磨前加入 100-200mg 组织分离粉)。再加入 300ul Buffer A,用吸头吹打几次后,开盖冰上孵育 5 分钟。接转步骤 4.

注意:存在少量的非均质组织不会影响样品的质量。塑料棒可重复使用。用 75% 酒精擦拭或用蒸馏水冲洗干净。

4. 盖上盖子,16,000Xg,离心 30 秒。(此步骤推荐使用可在 10S 内达到离心力的台式离心机,离心机的离心力和升速时间会影响膜蛋白得率)优化:细胞样品建议第 4 步完成后再次重悬细胞,转移回离心管柱中,16,000Xg 再次离心 30 秒,重复此步骤可以增加 20-30% 产量。

5. 弃去离心管柱,涡旋大力震荡 10 秒重悬细胞。

6.700Xg,离心 1 分钟(沉淀是完整的细胞核)。将上清转移到新的 1.5ml 离心管中,4℃,16000Xg 离心 10-30 分钟(延长离心时间可以增加产量),弃去上清(上清为胞浆组份),保存沉淀(沉淀为总膜蛋白组份包括细胞器和质膜)。

如果不需要分离质膜做到此步骤即可,产量一般为 10-500ug / 样品。可将总膜组份存储于 - 70℃或者根据下游实验选择溶解液溶解。如果需要提取质膜,请不要冷冻总膜组份。分离质膜继续第 7 步骤。

7. 加入 200ul Buffer B 用吸头反复吹打或涡旋震荡重悬总膜蛋白组份。4℃,7800Xg,离心 5 分钟(注意:如果最终质膜组份中含有细胞器膜污染,此步骤离心时间可增加到 20 分钟提高纯度,第一次使用建议按照说明书操作,无需调整离心时间)。沉淀部分为细胞器。

8. 小心的将上清液转移到新的 2.0ml 离心管中,加入 1.6ml 预冷的 PBS 混匀几次。16000Xg,离心 15-30 分钟(延长离心时间可以增加产量)。弃去上清液,保存沉淀(沉淀为质膜蛋白)。产量一般为 10-300ug / 样品。质膜蛋白可以根据下游实验需求用 20-200ul 含表面活剂的缓冲液溶解。

推荐使用下表中 MinuteTM 系列溶解液溶解膜蛋白。做等电聚焦(2D 凝胶第一维)我们建议使用:7M 尿素 / 2M 硫脲 / 2%Chaps 和 20mM DTT (使用前将 DTT 加入以上混合液中)。

传统的蔗糖梯度离心和双水相亲和性分离方法都需要通过特殊设备(匀浆机,搅拌机或超声波)匀浆来打破细胞膜,使用匀浆设备无法避免由于力度和时间不同造成的人为误差,是实验间差异的主要来源。

相比之下,使用离心管柱法提取膜蛋白,不需要使用任何匀浆设备,并且试剂盒不使用表面活性剂,操作简便,速度快,性能好,离心管柱法提取膜蛋白将成为越来越多研究人员的正确选择!

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