蛋白质组学

lowry法测定蛋白含量的方法 来自2010版药典

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本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白复合物,此复合物加入酚试剂后,产生蓝色化合物,该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质的含量成正比,根据供试品的吸光度,计算供试品的蛋白质含量。

试剂

(1) 酚试剂 称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MnO4·2H2O)25g,置1500ml蒸馏瓶中,加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml,上连回流管(使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞)微沸回流10 小时。取下回流管,加入硫酸锂150g、水50 ml、溴液几滴,煮沸约15分钟,驱除过量的溴。冷却,加水至1000ml,过滤,为酚试剂储备液。

酚试剂储备液用氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)测定酸浓度,然后加水稀释至相当于1mol/L沿酸浓度。

(2) 碱性铜溶液 量取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液各0.5ml,4%碳酸钠溶液与0.8%氢氧化钠溶液各25ml,摇匀,即得。本液临用配制。

(3) 氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)的配制及标定 去氢氧化钠适量,加水搅拌使溶解成饱和溶液,冷却后,置聚乙烯塑料瓶中,静置数日,澄清后,量取澄清的氢氧化钠饱和溶液28ml,加新煮沸后的冷却水,使成1000ml,摇匀。

取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g,精密称定,加新煮沸过的冷水50ml,振摇,使其尽量溶解;加酚酞指示剂2滴,用本液滴定;在接近终点时,应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解,滴定至溶液显粉红色。每1ml氢氧化钠滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量,算出本液的浓度。

标准蛋白溶液的制备 用水将蛋白标准品定量稀释至每1ml含1mg,作为储备液。精密量取储备液2.5ml置25ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即为每1ml含100µg的标准蛋白质溶液。

测定法 精密量取一定体积供试品(含蛋白质50µg左右)置试管内,加水至1ml,加碱性铜溶液5ml,摇匀,室温放置10分钟,快速加入酚试剂0.5ml摇匀,室温放置30分钟,显色后,照紫外-可见分光光度法(附录ⅡA),在波长650nm处测定吸光度(呈色后,如果发现浑浊,经每分钟3000转离心15分钟后,取上清液测定)。精密量取标准蛋白溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于试管中,自“加水至1ml”起,同法操作。准确量取水1ml,自“加碱性铜溶液5ml”起,同法操作,作为空白对照。以标准品的蛋白质浓度对其相应吸光度做直线回归,求得直线回归方程,即得供试品的蛋白质含量。

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