蛋白质组学

western blotting的转膜步骤

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下面的步骤适用于通过XCell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果,用户的优化是必要的。
I. 所需材料: •Xcell SureLock™或Xcell Ⅱ™ Mini-Cell以及Blot Module(Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051)•电泳后的迷你胶(mini-gel)(最大的尺寸9cm*9cm)•预先切割好的印记膜:
硝酸纤维素(Cat. no. LC2000或LC2001),
PVDF(Cat. No. LC2002)或Nylon+(Cat. No. LC2003)•转印垫(Cat. No. EI9052)•甲醇•去离子水 •转移缓冲液(配方见下文)•用于平衡膜,滤纸和转移垫的浅盘
II. 规格:
转印槽尺寸: 14.5cm x 14cm x 11cm
Blot Module容积:约200ml
下缓冲液槽容积:600ml
Blot尺寸: 约9cm*9cm
注意:在以下步骤中,应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染,并防止接触电泳和电转过程中常用的刺激物。
Ⅲ 材料制备
a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的Towbin缓冲液,其中含有20%的甲醇。使用Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜,0.5Xtowbin缓冲液就可以提供足够的离子强度,而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合其它的转印系统,反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下( 含20%甲醇的0.5X Towbin)
使用我们的Tris-Glycine转膜缓冲液: 去离子水760 ml转膜缓冲液(Cat. No. LC3675)40 ml(25×未稀释液) 甲醇200 ml总体积1000 ml自己制备Tris-Glycine转膜缓冲液: Tris 碱 (12mM)1.45 g甘氨酸 (96mM)7.2 g甲醇(20%终浓度)200 ml去离子水加至1L总体积1L
请参看Invitrogen 目录648页制备NuPAGE®转膜缓冲液。
b) 制备转印垫- 用大约700ml的转印缓冲液浸泡转印垫至饱和,浸泡在缓冲液中时注意挤压转印垫去除气泡,这一步骤是必需的,因为不去除气泡可能会阻碍生物分子的转印。
c) 制备转印膜和滤纸- 将选择的转印膜和滤纸按凝胶尺寸裁好或使用预先裁好的膜/滤纸复合层。
•PVDF膜-预先将PVDF膜在甲醇,乙醇或异丙醇中湿润。在去离子水中稍事润洗后,将膜放入含50-100ml转膜缓冲液的浅盘中放置数分钟。•硝酸纤维素膜/尼龙膜-直接放入转膜缓冲液中数分钟。•滤纸-在临使用前在转膜缓冲液中简单浸泡一下。•凝胶-凝胶应在跑完后立刻使用,讨论见下文。不要将凝胶浸泡在转膜缓冲液中。

Ⅳ 制备凝胶及膜的夹层:

 

凝胶和膜的夹层以及转印垫应放置在转印模块的阴极,使其与转印单元的底部水平。

转印垫和组装体就位后,在电极的上方应有约1cm的缝隙(图1 )。

Ⅳ-A. 转印一块凝胶 1.在电泳后,将切胶刀的斜边楔入胶盒两块板之间的缝隙中,撬开每边的三个粘合点。胶盒的凹口(加样孔)面应面向上。在刀柄上来回推动以分离胶板。在胶盒的各边缘重复直至胶板完全分离。当将切胶刀插入到两块胶板之间时必需小心,以免对凝胶压力过大。
2.当打开胶盒时,凝胶会粘附在胶盒的一边。小心移除无凝胶的胶板,使凝胶留存在另一块胶板上。用切胶刀切除加样孔。
3.将一片预先浸泡过的滤纸放在凝胶顶部,刚好在凝胶底部的"底脚"的上部(不覆盖凝胶的底脚)。使用转印缓冲液持续饱和滤纸,确保赶走了进入的气泡。可以使用玻璃移液管作为滚筒,轻轻在表面滚动,从而很容易做到这点。
4.将胶盒翻转,使凝胶和滤纸面向下放置在戴手套的手掌上或者放有一片Parafilm?膜的干净平面上。使用下面的一种方法将凝胶从胶板上分离:
a) 如果凝胶在较长(有狭缝)的胶板上,用切胶刀通过胶盒上的狭缝轻推底部,凝胶将很容易从胶板分离。
b) 如果凝胶在较短(有凹口)的胶板上,使用切胶刀小心松凝胶的底部,使凝胶从胶板滑离。

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