蛋白质组学

Western blot中硝酸纤维膜和PVDF膜的选择及其特点

western blot 中膜的选择是实验成功的关键点,Western blot实验中一般可以选择硝酸纤维膜(NC) 和PVDF膜,那NC膜和PVDF膜有什么区别呢?怎样才能选择最恰当的杂交膜进行Western blot实验呢?

NC膜 PVDF膜 尼龙膜的特点

解答:尼龙膜是较理想的核酸固相支持物,有多种类型;硝酸纤维素膜(NC膜)是目前应用最广的一种固相支持物,价格最便宜;PVDF膜介于二者之间。

就结合能力而言:尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480-600μg/cm2,可结合短至10bp的核酸片段;硝酸纤维素膜(NC膜)结合DNA和RNA能力可达80-100μg/cm2,对于200bp的核酸片段结合能力不强;PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125-300μg/cm2。

就温度适应性而言:尼龙膜经烘烤或紫外线照射后,核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合;硝酸纤维素膜(NC膜)依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不牢固;PVDF膜结合牢固,耐高温,特别适合于蛋白印迹 。

就韧性而言:尼龙膜较强;硝酸纤维素膜较脆,易破碎;PVDF膜较强。

就重复性而言:尼龙膜可反复用于分子 杂交,杂交后,探针分子可经碱变性被洗脱下来;硝酸纤维素膜(NC膜)不能重复使用;PVDF膜可以重复使用。

Western Blot时该选择NC膜还是PVDF膜?

硝酸纤维素膜:硝酸纤维素膜(NC膜)是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲 液的环境下,大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起,虽然这其中的机制还不是十分清楚,但由于硝酸纤维素膜(NC膜)的这个特性,而且易于封闭非特异性结合,从而得到了广泛的应用。

在非离子型的去污剂作用下,结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小,要选择不同 孔径的硝酸纤维素膜(NC膜)。因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm,蛋白的转移就很难进行了。

因此,我们通 常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜,小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了,如果用 0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。从膜的质地上来看,最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。

硝酸纤维素膜(NC膜)的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关,市场上有些硝酸纤维素膜(NC膜)通常会还有大量的醋酸纤维素,因而降低了蛋白的结合量。如果采用的是100%纯度的硝酸纤维素, 保证了最大的蛋白结合量,可达80-150μg/cm2。

由于100%的纯度,因而也大大减少了非特异性的结合,降低杂交背景,无 需高严谨度的洗脱步骤。其次,膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜比较脆,漂洗一两次就会破损,不能反复使用。

PVDF转移膜:PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质,通常是用来制造水管的。

PVDF膜可以结合蛋白质,而且可以分离小片段的蛋白质,最初是将它用于蛋白质的序列测定,因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解,所以就寻找了 PDVF作为替代品,虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高,但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品,一直沿用至今。

PVDF膜与 硝酸纤维素膜一样,可以进行各种染色和化学发光检测,也有很广的适用范围。这种PVDF膜,灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高,非 常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。

使用PVDF膜时,一定要先用无水甲醇预处理,再在transfer buffer中平衡好才可以使 用(PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合)。经过预处理的PVDF膜在转膜时, 可以使用不含甲醇的transfer buffer。而使用NC膜时,有的需要用无水甲醇处理,有的则不必,直接用transfer buffer平衡好就可以了。

小结:综上所述,可以根据硝酸纤维膜膜和PVDF膜的特点,以及实验的目的去选择杂交膜,例如使用PVDF膜之前一定要经过甲醇处理,当抗原抗体识别识别需要维持其三级结构时,则选择NC膜。

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