蛋白质组学

酵母双杂交的实验步骤

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LexA酵母双杂交系统简介

一、LexA酵母双杂交系统的设计原理

报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除,因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下,报告基因LacZ的转录活性为零,该基因的筛选标志为URA3,可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中,也可以被整合到EGY48基因组 DNA上。

质粒 pLexA的筛选标志为HIS3,在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵,Bait)的融合蛋白,该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控,选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1,在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游,含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli 的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列,共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。

在酵母EGY48的基因组 中还整合有另一个报告基因Leu,它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA,但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理,如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性,即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体 和pB42AD质粒载体的多克隆位点中,然后共同转入含有报告基因的酵母菌株,如果蛋白X与Y能相互作用,则启动报告基因的转录和表达,通过检测报告基因的表达情况,就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库,则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白,并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。

二、商品化酵母双杂交系统的组成

1. 载体质粒:pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库

2. 酵母菌株:EGY48、EGY48(p8op-LacZ)、YM4271(EGY48的伴侣菌株)

3. 大肠杆菌菌株:E.coli KC8株

4. 对照质粒:

质 粒 用途

pLexA-53,pB42AD-T 阳性对照

pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕 阳性对照

pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒

5. 引物:

pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

三、酵母双杂交实验的基本流程

1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株,用培养基SD/-Ura筛选。

2. 同时构建或扩增DNA文库,并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。

3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X,作为钓饵(bait)。

4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株,用SD/-His/-Ura筛选;并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性,以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。

转化质粒 选择培养基 克隆生长情况 说 明

(含有Gal/Raf)

pLexA-Pos SD/-His,-Ura 蓝 阳性对照

pLexA SD/-His,-Ura 白 阴性对照

PlexA-X SD/-His,-Ura 白 没有直接激活活性

PlexA-X SD/-His,-Ura 蓝 具有直接激活活性

PlexA-X SD/-His,-Ura 菌落不能生长 酵母细胞毒性

4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。b能够自动激活报告基因,则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组,减少

4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因,但对酵母宿主细胞有毒性,则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。

5. 如果pLexA-X既不会自动激活报告基因,也不具有毒性,则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞,并检测质粒转化效率。

转 化 质粒 SD固体培养基 LacZ表型

对照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝

对照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝

+pB42AD-T

实 验 pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测

+pB42AD-文库

5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子,并扩增,使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。

-半乳糖苷酶无表达。b5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu,观察LacZ及Leu报告基因的表达情形,蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性,说明Leu虽有表达,但

5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的,是为了尽可能消除实验的假阳性误差,譬如:AD融合蛋白不与目标蛋白结合,而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同,出现上述假阳性的几率就大大减少了。

5-4. 将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种,尽可能分离克隆中的多种文库质粒。

6. 阳性克隆的筛选

6-1. 随机选取50个阳性克隆,扩增、抽提酵母质粒,电转化E.coli KC8宿主菌,抽提大肠杆菌中的质粒,酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。

6-2. 如果重复的插入序列较多,可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列,再转化新的宿主细胞,检测是否仍为阳性克隆。

7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆

7-1. 将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基,培养1-2天,含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中,将以10%-20%左右的频率随机丢失。

C孵育2-3天。°7-2. 将上述克隆,转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura,30

7-3. 再挑取生长的单克隆,转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中,筛选His表型缺陷的克隆,即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。

7-4. 将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura,以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达,弃去阳性克隆,保留阴性克隆。

8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆

如下表所示,在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA,通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。

质粒1

(in YM4271) 质粒2

(in EGY48) LacZ表型 Leu表型

pLexA pB42AD 白 不能生长

pLexA-靶DNA pB42AD 白 不能生长

pLexA pB42AD-文库 白 不能生长

pLexA-靶DNA pB42AD-文库 蓝 真 阳 性

pLexA-Lam pB42AD-文库 白 不能生长

9. 阳性克隆的进一步筛选和确证

9-1. 扩增初步确定的阳性克隆,抽提酵母DNA。该DNA为混合成份,既含有酵母基因组DNA,也含有3种转化的质粒DNA。

9-2. 将上述DNA电转化E.coli KC8宿主菌。由于在大肠杆菌中,具有不同复制起始调控序列的质粒不相容;同时利用营养缺陷型筛选。因此,在M9/SD/-Trp培养基上,只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长,将其扩增、并抽提质粒DNA,酶切鉴定。

9-3. 用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中,先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增,并与后面的诱导板形成对照,说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关,再确证LacZ、Leu报告基因的表达。

9-4. 扩增与靶DNA相互作用的文库DNA,进行序列分析及进一步的结构、功能研究。

10. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究

10-1. 用不同的双杂交系统验证

10-1-1. 将载体 pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。

10-1-2. 选择不同的双杂交系统,如:以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。

10-1-3. 将文库质粒移码突变后,再与靶质粒作用,报告基因是否仍能被激活。

-半乳糖苷酶水平,比较作用强度变化。b10-1-4. 去除或突变特定结合位点,定量检测

10-2. 用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列,证明其编码区域。

10-3. 用其它的检测方法,如:亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。

10-4. 进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系

构建于AD载体的cDNA文库的扩增

1. 自-80℃冰箱取出含有cDNA文库的甘油菌,置于冰浴中缓慢化冻。

2. 用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释。

lml加入90m3. 取稀释菌液各10 90mm);37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr,计数平板上单克隆菌落数。fLB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀,涂布LB/Amp平板(

4. 确定待扩增的cDNA文库滴度(cfu/ml)=克隆数×108(1:106稀释)或克隆数×1010(1:108稀释)。

5. 按照>150mm),共100块;37℃倒置培养过夜。f2-4×104cfu/平板的浓度,涂布LB/Amp平板(

6. 在超净工作台上,在所有生长菌落的平板上加适量LB培养液,将菌落刮下,转入2000ml LB/Amp培养液中,37℃振荡培养2-4hr。

7. 留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度,分装,保存于-80℃。

8. 其余培养菌液离心8000xg×10min,4℃收集细菌;用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。

LB液体培养基,121℃,15lb/in2灭菌15min

A. bacto-Tryptone 10.0g

B. bacto-Yeast Extract 5.0g

C. NaCl 10.0g

D. ddH2O → 1000 ml

* LB固体培养平板为含有1.5%琼脂(Agar)LB培养基。

** LB/Amp培养基为含有Amp g/ml的LB培养基。m50-100

构建于AD载体的cDNA文库的纯化

1. 质粒DNA提取缓冲液

名 称 缓冲 液 配 方

g/ml RNasemP1 悬浮缓冲液 50mM Tris-HCl(pH8.0);10mM EDTA;100 A

P2 裂解缓冲液 200mM NaOH;1% SDS

P3 中和缓冲液 3.0M Kac(pH5.5)

QBT 平衡缓冲液 750mM NaCl;50mM MOPS(pH7.0);15%异丙醇;0.15% Triton X-100

QC 洗涤缓冲液 1.0 M NaCl;50mM MOPS(pH7.0);15%异丙醇

QF 洗脱缓冲液 1.25 M NaCl;50mM Tris-HCl(pH8.5);15%异丙醇

2. 培养菌液离心6000xg×10min,4℃,每500ml培养物(下同)的沉淀重悬于50ml P1缓冲液。

3. 加入50ml P2缓冲液,倒置4-6次混匀,室温孵育5min。

4. 加入4℃预冷的50ml P3缓冲液,快速倒置4-6次混匀,冰浴30min(其间再倒置混匀4-6次)。

5. 将上述混合液再倒置混匀,离心12000xg×30min,4℃,保留上清。

6. 上清再离心12000xg×15min,4℃,留上清。

7. 将上清液上样于经35ml QBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱。

8. 以100ml QC缓冲液洗涤层析柱2次。

9. 以35ml QF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA。

10. 以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA,离心12500xg×30min,4℃,小心去除上清。

11. 以7ml 70%乙醇洗涤沉淀DNA,离心12500xg×10min,4℃,小心去除上清。

12. 将沉淀的质粒DNA溶于5ml TE(pH8.0)缓冲液,转移至新的无菌离心管中,用2.5倍体积无水乙醇;1/10体积3.0M NaAc(pH5.2),于-20℃静置过夜。

13. 离心12500xg×20min,4℃,去除上清,沉淀用70%乙醇洗涤,超净台风干。

l),保存于-20℃。mg/管(用于1次转化反应,约40m14. 干燥的DNA溶于适量体积TE,定量,分装100-200

构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞

1. 将酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接种于5.0ml SD/-Ura液体培养基中,缓振打散菌落,然后转入95.0ml SD/-Ura液体培养基中,30℃恒温,250rpm振荡培养16-18hr,至OD600>1.0。

SD/-Ura液体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A. Difco Nitrogen 0.67g

B. 葡萄糖 2.00g

C. 10×DO(-His,-Leu,-Trp,-Ura) 10.0ml

D. 20×His 5.0ml

E. 20×Leu 5.0ml

F. 20×Trp 5.0ml

G. ddH2O → 100.0ml

2. 将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD,至OD600=0.2-0.3(约50ml),30℃恒温,250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。

YPD液体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A. Polypepton 6.0g

B. bacto-Yeast Extract 3.0g

C. 葡萄糖 6.0g

D. ddH2O → 300 ml

3. 室温离心5000xg×5min,弃上清;加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞,离心弃上清,沉淀用1×TE/LiAc重悬后,即为酵母感受态细胞。

4. 准备下列试剂

2×转化反应 10×TE 10×LiAc 50% PEG ddH2O

lml / 120ml 15mA. 1×TE/LiAc 0.15ml 15

l /ml 960ml 120mB. PEG/LiAc 1.20ml 120

lml / / 900mC. 1×TE 1.00ml 100

5. 分装待转化的质粒DNA,振荡混匀。

lmg) 3-5mA. pLexA-X(0.1

B. 10mg/ml lmSperm DNA*(0.1mg) 10

* 新配制时水浴煮沸20min后,插入冰浴,保存于-20℃。

l用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞,振荡混匀。m6. 每管加入100

lm7. 各加入600 PEG/LiAc,振荡混匀,30℃恒温,250rpm振荡培养30min。

lm8. 各加入70 DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min,迅速插入冰浴。

9. 室温离心13000xg×10sec,尽量弃上清;以0.3ml 1×TE重悬沉淀细胞,涂布SD/-Ura,-His固体培养板,30℃倒置培养3-5天。

SD/-Ura,-His固体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板

A. Difco Nitrogen 1.34g

B. 葡萄糖 4.00g

C. 10×DO(-His,-Leu,-Trp,-Ura) 20.0ml

D. 20×Leu 10.0ml

E. 20×Trp 10.0ml

F. Agar 4.00g

G. ddH2O 90-100mm)f→ 200.0ml 铺8-10块平板(

附表1. 不同规模转化酵母感受态细胞

Small Scale* Large Scale Library Scale

转 化 反 应 20 1 1

(1) SD液体培养基扩增酵母菌 100ml 100ml 300ml

(2) YPD液体培养基扩增酵母菌 300mla 300mla 1000mla

(3) TE或ddH2O洗涤酵母细胞 15mlc 25-50mlb 500mla

(4) 准备 A. 1×TE/LiAc缓冲液 1.5mld 1.0mld 8.0mlc

B. PEG/LiAc缓冲液 12.0mlc 6.0mlc 100.0mlb

C. 1×TE缓冲液 6.0mlc 10.0mlc 10.0mlc

(5) 分装 A. DNA-BD vector gd×20 / 0.2-1.0mgcm 0.1

gd 0.1-0.5mgmg×20 10-50mB. AD vector 0.1

C. l 2.0mlml×20 200mSperm DNA(10mg/ml) 10

1×TE/LiAc重悬感受态细胞 1.5mlc 1.0mlc 8.0mlb

l×20 1.0ml 8.0mlm酵母感受态细胞 100

(7) PEG/LiAc缓冲液 0.6ml×20 6.0ml 60.0ml

l 7.0mlml×20 700m DMSO 70

(9) 室温离心后弃上清 13000xg×10sec 2000xg×5min 2000xg×5min

(10) 1×TE重悬感受态细胞 0.3ml×20 6.0ml 10.0ml

150mm×50f150mm×30 f90mm×20 f铺固体选择培养基平板

注: * 即为“构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞”

** 在不同容积的无菌离心管中进行,a: 300或500ml;b: 50ml;c: 15ml;d: 1.5ml

文库cDNA转化含有DNA-BD载体的酵母感受态细胞

1. 以生长于SD/-Ura,-His固体培养板上的含有构建于DNA-BD载体的目的DNA及报告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作为宿主菌,制备酵母感受态细胞。

2. 将酵母宿主菌接种于5.0ml SD/-Ura,-His液体培养基中,缓振打散菌落,然后转入95.0ml SD/-Ura,-His液体培养基中,30℃恒温,250rpm振荡培养16-18hr,至OD600>1.0。

SD/-Ura,-His液体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A. Difco Nitrogen 0.67g

B. 葡萄糖 2.00g

C. 10×DO(-His,-Leu,-Trp,-Ura) 10.0ml

D. 20×Leu 5.0ml

E. 20×Trp 5.0ml

F. ddH2O → 100.0ml

3. 将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD,至OD600=0.2-0.3(约50ml),30℃恒温,250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。

YPD液体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A. Polypepton 6.0g

B. bacto-Yeast Extract 3.0g

C. 葡萄糖 6.0g

D. ddH2O → 300 ml

4. 室温离心5000xg×5min,弃上清;加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞,离心弃上清,沉淀用1×TE/LiAc重悬后,即为酵母感受态细胞。

5. 准备下列试剂

1×转化反应 10×TE 10×LiAc 50% PEG ddH2O

lml / 800ml 100mA. 1×TE/LiAc 1.0ml 100

l 4.8ml /ml 600mB. PEG/LiAc 6.0ml 600

C. 1×TE 10.0ml 1.0ml / / 9.0ml

6. 取1.0ml用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞,加入下列成份,振荡混匀。

lmg) 40mA. pB42AD-Library(50-100

B. 10mg/ml lmHerring DNA*(2.0mg) 200

* 新配制时水浴煮沸20min后,插入冰浴,保存于-20℃。

7. 加入6.0ml PEG/LiAc,振荡混匀,30℃恒温,250rpm振荡培养30min。

lm8. 加入700 DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min,迅速插入冰浴。

9. 室温离心2000xg×5min,尽量弃上清。

10. 以6.0ml 100mm,每稀释度各×2),30℃倒置培养3-5天,确定转化效率在2×106cfu以上有效。fl稀释不同倍数,涂布SD/-Ura,-His,-Trp固体培养板(m1×TE重悬沉淀细胞,取10

150mm×30),30℃倒置培养3-5天。fl涂布SD/-Ura,-His,-Trp固体培养板(m11. 按每板200

SD/-Ura,-His,-Trp固体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板

A. Difco Nitrogen 13.40g

B. 葡萄糖 40.00g

C. 10×DO(-His,-Leu,-Trp,-Ura) 200.0ml

D. 20×Leu 100.0ml

E. Agar 40.00g

F. ddH2O 150mm)f→ 2000.0ml 铺30块平板(

12. 在超净工作台上,在所有生长菌落的平板上各加5ml TE(pH7.0)缓冲液,将菌落刮下。

13. 离心弃上清,加入10-20ml TE缓冲液重悬沉淀菌,加入等体积的无菌65%甘油-MgSO4缓冲液,混匀,分装1.0ml/管,保存于4℃ 1周或-80℃1年以上。

65%甘油-MgSO4缓冲液: 65%甘油;100mM MgSO4;25mM Tris-HCl(pH8.0)

A. 甘油 65.00ml

B. MgSO4•7H2O 2.465g

C. 2.0 M Tris-HCl(pH8.0) 1.25ml

D. ddH2O → 100.00ml

酵母双杂合系统阳性克隆的筛选

1. 经过选择培养基筛选的含有DNA-BD载体、文库DNA及报告基因的酵母感受态细胞,用无菌TE稀释至1:104、1:106和1:108等不同浓度。

90mm),30℃倒置培养3-5天,计数平板上单克隆菌落数。fl,涂布SD/-Ura,-His,-Trp固体培养板(m2. 取上述稀释菌液各100

3. 确定待进一步鉴定的酵母菌滴度(cfu/ml)=克隆数×105(1:104稀释)、克隆数×107(1:106稀释)或克隆数×109(1:108稀释)。

4. 按照以前实验确定的文库转化效率的5-10倍的总量、0.5-2×106cfu/平板的菌量,涂布SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养板,30℃倒置培养3-5天。

5. 挑取显蓝色的菌落,再接种于SD/-Ura,-His,-Trp固体培养基以及SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养基,以进一步确证。

SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养基

A. SD/Gal/Raf 3.79g

B. 10×DO(-His,-Leu,-Trp,-Ura) 10.0ml

C. Agar 2.00g

D. ddH2O → 85.0ml

灭菌(115℃,10lb/in2)15min ,冷却至50℃,加入下列成份后铺板

E. 10×BU 10.0ml

F. 20mg/ml X-gal 0.4ml 90-100mm)f铺5-6块平板(

10×BU缓冲液,121℃,15lb/in2灭菌15min

A. Na2HPO4•12H2O 9.30g

B. NaH2PO4•2H2O 3.90g

C. ddH2O → 100.0ml

20mg/ml X-Gal

A. X-Gal 40mg

B. DMF 2ml

酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定

-酵母质粒DNA的提取

1. 挑取经过酵母选择/诱导培养基初步鉴定的酵母单菌落,接种于5.0-10.0ml SD/-Trp液体培养基,30℃恒温,250rpm振荡培养20hr。

SD/-Trp液体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A. Difco Nitrogen 0.67g

B. 葡萄糖 2.00g

C. 10×DO(-His,-Leu,-Trp,-Ura) 10.0ml

D. 20×His 5.0ml

E. 20×Leu 5.0ml

F. 20×Ura 5.0ml

G. ddH2O → 100.0ml

2. 室温离心5000xg×1min,弃上清,收菌。

l酵母裂解液,振荡重悬沉淀酵母菌。m3. 加入200

酵母裂解液: 2% Triton X-100;1% SDS;100mM NaCl;10mM Tris-HCl(pH8.0);1mM EDTA

A. 10% Triton X-100 20.0ml

B. 10% SDS 10.0ml

C. NaCl 0.58g

D. Tris 0.12g

E. EDTANa2•2H2O 0.04g

F. 1.0M HCl调pH8.0

G. ddH2O → 100.0ml

4. 加入下列试剂,充分振荡5min;液氮冻存10min,室温复融;再充分振荡5min。

A. 经酸处理的玻璃珠(Sigma) 0.20g

B. 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 0.2ml

5. 室温离心12000xg×10 min,将上清转移至新的1.5ml 离心管中,加入下列试剂,于-70℃冻存30-60 min。

A. 3 M NaAc(1/10 lmV) 20

lmB. 无水乙醇(2.5V) 500

6. 离心12500xg×10 min,4℃,弃上清;70%乙醇洗涤沉淀,于 37℃烘箱或超净台干燥DNA;将干燥的沉淀DNA重溶于 l无菌ddH2O中,保存于-20℃。m20-30

酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定

-酵母质粒DNA电转化大肠杆菌

1. 在冰浴条件下,取待转化DNA l感受态细胞中,混匀。mg),加入100ml(5pg-0.5m1.0

WF,200m2. 将上述混合液加入间距0.1cm的样品杯中,电转化(1.8kV,25 。

3. 迅速加入1ml新鲜的LB培养液,混匀,转入1.5ml 离心管中,37℃恒温,150rpm振荡孵育30-60min。

4. 将上述转化反应液涂布M9/DO(-Trp)固体培养板,37℃倒置培养至单菌落出现(16-22hr)。

5. 按常规方法扩增上述阳性转化菌,碱裂解法少量抽提质粒DNA,酶切筛选AD载体上含有插入片段的阳性克隆,保存其于25%甘油,待进一步验证。

M9/DO-Trp固体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A. 葡萄糖 1.2g

B. Agar 6.0g

C. 5×M9缓冲液 60 ml

D. 10×DO(-His,-Leu,-Trp,-Ura) 30 ml

E. 20×His 15 ml

F. 20×Leu 15 ml

G. 20×Ura 15 ml

H. ddH2O 165 ml

冷却至50℃左右,加入下列成份,混匀铺板

I. 1.0M Thiamine-HCl(Vit.B1) 0.3 ml

J. 100mg/ml Amp 0.3 ml 90-100mm)f铺10-15块平板(

大肠杆菌感受态细胞的制备(电转化)

1. 挑取LB固体培养基上生长的E.coli KC8单菌落,接种于5ml LB液体培养基中,37℃恒温,250rpm振荡培养过夜(约12-14hr)。

2. 将2.5 ml新鲜菌液接种于500ml SOB培养液中,37℃恒温,250rpm振荡培养至OD600=0.5-0.6(约2.5-3hr)。

SOB液体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A. bacto-Tryptone 10.00g

B. bacto-Yeast Extract 2.50g

C. NaCl 0.25g

D. KCl 0.09g

E. MgCl2•6H2O 1.02g

F. ddH2O → 500.0ml

3. 将培养菌液收集于离心管中,冰水浴15-20min。

4. 离心6000xg×10min,4℃,弃尽上清;以5ml 预冷的无菌ddH2O重悬沉淀菌;再加入500ml预冷的无菌ddH2O洗涤细菌。

5. 重复上述步骤1次,以充分去除培养基中残余的盐离子成份。

6. 用40-50ml 预冷的无菌10% 甘油重悬沉淀细菌,转移至50ml 无菌离心管中;离心6000xg×10min,4℃,弃尽上清;重复此步骤1次。

7. 以等体积(约1.5-2.0ml) 预冷的无菌10% 甘油重悬上述沉淀的感受态细胞,分装0.5ml/管(5-6次转化反应),保存于-80℃备用。

酵母双杂合系统阳性克隆的确证

1. 以含有报告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作为转化宿主菌。

2. 将酵母宿主菌接种于5.0ml SD/-Ura液体培养基中,缓振打散菌落,然后转入95.0ml SD/-Ura液体培养基中,30℃恒温,250rpm振荡培养16-18hr,至OD600>1.0。

SD/-Ura液体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A. Difco Nitrogen 0.67g

B. 葡萄糖 2.00g

C. 10×DO(-His,-Leu,-Trp,-Ura) 10.0ml

D. 20×His 5.0ml

E. 20×Leu 5.0ml

F. 20×Trp 5.0ml

G. ddH2O → 100.0ml

3. 将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD,至OD600=0.2-0.3(约50ml),30℃恒温,250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。

YPD液体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A. Polypepton 6.0g

B. bacto-Yeast Extract 3.0g

C. 葡萄糖 6.0g

D. ddH2O → 300 ml

4. 室温离心5000xg×5min,弃上清;加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞,离心弃上清,沉淀用1×TE/LiAc重悬后,即为酵母感受态细胞。

5. 准备下列试剂

20×转化反应 10×TE 10×LiAc 50% PEG ddH2O

l / 1.2mlml 150mA. 1×TE/LiAc 1.5ml 150

B. PEG/LiAc 12.0ml 1.2ml 1.2ml 9.6ml /

C. 1×TE 10.0ml 1.0ml / / 9.0ml

6. 分装待转化的质粒DNA。

A. pLexA lmg) 3-5mor pLexA-X(0.1

lmg) 3-5mB. pB42AD-Y(0.1

C. 10mg/ml Sperm lmDNA*(0.1mg) 10

* 新配制时水浴煮沸20min后,插入冰浴,保存于-20℃。

l用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞,振荡混匀。m7. 每管加入100

lm8. 各加入600 PEG/LiAc,振荡混匀,30℃恒温,250rpm振荡培养30min。

lm9. 各加入70 DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min,迅速插入冰浴。

10. 室温离心13000xg×10sec,尽量弃上清;以0.3ml 1×TE重悬沉淀细胞,涂布SD/-Ura,-His,-Trp固体培养板,30℃倒置培养3-5天。

SD/-Ura,-His,-Trp固体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板

A. Difco Nitrogen 3.35g

B. 葡萄糖 10.00g

C. 10×DO(-His,-Leu,-Trp,-Ura) 50.0ml

D. 20×Leu 25.0ml

E. Agar 10.00g

F. ddH2O → 500.0ml 90-100mm)f铺20-25块平板(

11. 挑取上述固体培养基上生长的含有目的DNA(X)的pLexA-X(+)或空载pLexA(-)单菌落,分别接种SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养板,30℃倒置培养3-5天。

SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养基

A. SD/Gal/Raf 3.79g

B. 10×DO(-His,-Leu,-Trp,-Ura) 10.0ml

C. Agar 2.00g

D. ddH2O → 85.0ml

灭菌(115℃,10lb/in2)15min ,冷却至50℃,加入下列成份后铺板

E. 10×BU 10.0ml

F. 20mg/ml X-gal 0.4ml 90-100mm)f铺5-6块平板(

12. 选择含有pLexA-X显蓝色,而相应的不含有插入DNA的空载pLexA显白色的克隆,扩增其在E.coli KC8中的甘油菌,按常规抽提质粒DNA,进行序列分析。

10×DO(-His,-Trp,-Leu,-Ura)

为不含His,Trp,Leu,Ura等成份的10×Dropout溶液。

每1000ml溶液中含有下列成份,用ddH2O配制后保存于4℃。

(1) L-Isoleucine L-异亮氨酸 300mg

(2) L-Valine L-缬氨酸 1500mg

(3) Adenine 腺嘌呤 200mg

(4) L-Arginine HCl L-精氨酸 200mg

(5) L-Lysine HCl L-赖氨酸盐酸盐 300mg

L-Methionine L-甲硫氨酸 200mg

(7) L-Phenylalanine L-苯丙氨酸 500mg

L-Threonine L-苏氨酸 2000mg

(9) L-Tyrosine L-酪氨酸 300mg

20×氨基酸储存液

每100ml溶液中分别含有下列成份,配制后保存于4℃。

20×His L-Histidine L-组氨酸 40mg

20×Trp L-Tryptophan L-色氨酸 40mg

20×Leu L-Leucine L-白氨酸 200mg

20×Ura Uracil 尿嘧啶 40mg

酵母转化缓冲液:

缓冲液 体积 缓冲液配制

10×TE 100ml Tris 1.21g;EDTANa2•2H2O 0.37g;ddH2O 80ml;盐酸调pH7.5;ddH2O定容

10×LiAc 100ml LiAc•2H2O 10.20g;ddH2O 50ml,冰醋酸调pH7.5;ddH2O定容

50% PEG 100ml PEG3350 50.0g;ddH2O定容

其它缓冲液:

缓冲液 体积 缓冲液配制

TE 1000ml Tris 1.21g;EDTANa2•2H2O 0.37g;ddH2O 800ml;盐酸调pH;ddH2O定容

STE 1000ml NaCl 5.84g;Tris 1.21g;EDTANa2•2H2O 0.37g;ddH2O 800ml;盐酸调pH8.0;

ddH2O定容

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