蛋白质组学

蛋白质定量——BCA(二辛可酸)法蛋白定量

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在蛋白质定量试验中,最常用的方法是BCA法蛋白定量 。那么为什么我们要选择用BCA法?因为BCA发蛋白定量具有很多优点,如1.实验操作十分简单方便;2.实验耗时短,快速;3.试剂灵敏度高,实验结果准确;4.所用的试剂稳定性好,而且经济实用,抗干扰能力强等。

实验原理:

BCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓度定量:在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+(biuret reaction)。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。

实验步骤:

1. 先将solutionA 摇晃混匀,根据样品数量,按50体积solution A加1体积solutionB试剂(50:1)配制成BCA工作液,充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。

2.稀释标准品:完全溶解蛋白质标准品(5mg/mlBSA,-20℃保存)取10微升用PBS 稀释至100微升(样品一般可用PBS稀释),使终浓度为 0.5mg/ml。

将稀释后的标准品(0.5mg/ml)按0, 2, 4,6,8, 12, 16, 20微升分別加到96孔板的蛋白标准品孔中,加标准品稀释液补足到20微升。

3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中,加标准品稀释液不足道20ul。

即:将蛋白质样品作适当稀释(最好多做几个梯度,如作2倍、4倍、8倍稀释。

4.在 各孔中加入200微升BCA工作液,这时使用加样枪轻柔吹打,将其中液体混匀,这时请注意,尽量小一点力气轻柔一点,不要弄出很多气泡,这样会影响读数),然后再37℃室内放置30-60min。将液体冷却至室温,在酶标仪 上测定A562nm,或540-590nm之间的波长的吸光值,最后可根据标准曲线计算出蛋白质的浓度,为样品蛋白质定量。

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