蛋白质组学

考马斯亮蓝法测蛋白含量:标准曲线制作

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一、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

(一)、试剂:

1、考马斯亮蓝试剂:

考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)H3PO4。

2、标准蛋白质溶液:

纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

(二)、器材:

1、722S型分光光度计 使用及原理()。

2、移液管使用()。

(三)、标准曲线制作:

1、

试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白(ml) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 (ml) 5 5 5 5 5 5 5
摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm &NBS p; &NBS p; &NBS p; &NBS p;      

2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。

1)、利用标准曲线查出回归方程。

2)、用公式计算回归方程。

3)、或用origin作图 ,测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6

一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上。

4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。

(四)、蛋白质含量的测定:

样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。

(五)、注意事项:

1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。

对照:用被测物质以外的物质作空白对照。

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