蛋白质组学

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理、步骤及注意事项

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蛋白质浓度测定的方法有很多,考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式,它利用比色法和色素法混合方法、操作简便,下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。

实验原理

考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465nm变为 595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是:

(1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。

此法的缺点是:

(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。

试剂与器材

一、试剂

考马斯亮蓝试剂:

考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中,加入100mL 85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000mL。

二、标准和待测蛋白质溶液

1.标准蛋白质溶液

结晶牛血清蛋白 ,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。

2.待测蛋白质溶液。

人血清,使用前用0.15mol/L NaCl稀释200倍。

三、器材

试管1.5×15cm(×6),试管架,移液管管0.5mL(×2);1mL(×2);5mL(×1);恒温

水浴;分光光度计

操作方法

一、制作标准曲线

取7支试管,按下表平行操作。

试管编号

0

1

2

3

4

5

6

标准蛋白溶液(mL)

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.15mol/L NaCl(mL)

0.1

0.09

0.08

0.07

0.06

0.05

0.04

考马斯亮蓝试剂(mL)

5mL

摇匀,1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色

A595nm

       

 

   

绘制标准曲线:以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。

二、未知样品蛋白质浓度测定

测定方法同上,取合适的未知样品体积,使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。

注意事项

在试剂加入后的5-20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。

测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用,重复测定吸光度时,比色杯一定要冲洗干净,制作蛋白标准曲线的时候,蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定,防止误差。

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