蛋白质组学

紫外吸收法

相关专题
 

蛋白质分子 中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析 洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。
此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

1. 280nm的光吸收法
因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收,且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大,因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
测定时,将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中,用配制蛋白质溶液的溶剂(水或缓冲液)作空白对照,在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿,盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时,A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值(A1%1cm)有文献数据可查,根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与(A1%1cm)值(即蛋白质溶液浓度为1%,光径为1cm时的光吸收值)的关系。文献值A1%1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
蛋白质浓度 = (A280´10 )/ A1%1cm,280nm (mg/ml)
(Q 1%浓度»10mg/ml)

2. 280nm和260nm的吸收差法
核酸对紫外光有很强的吸收,在280nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克),但核酸在260nm处的吸收更强,其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍,而蛋白质则相反,280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常:
纯蛋白质的光吸收比值:A280/A260 » 1.8
纯核酸的光吸收比值: A280/A260 » 0.5
含有核酸的蛋白质溶液,可分别测定其A280和A260,由此吸收差值,用下面的经验公式,即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A280-0.74×A260 (mg/ml)
此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。

3. 215nm与225nm的吸收差法
蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时,可用215nm与225nm吸收值之差,通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
用已知浓度的标准蛋白质,配制成20~100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液,分别测定215nm和225nm的吸光度值,并计算出吸收差: 吸收差D= A215 -A225
以吸收差D为纵座标,蛋白质浓度为横座标,绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差,即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内,蛋白质浓度与吸光度成正比,NaCl、(NH4)2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液,都无显著干扰作用,但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大,必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。

4. 肽键测定法
蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱,与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液,测定238nm的光吸收值A238,以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标,绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
进行蛋白质溶液的柱层析分离 时,洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。
本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物,如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐,无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂,可先将样品蒸干,或用其他方法除去干扰物质,然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。

(0)

热评文章

发表评论