蛋白质组学

蛋白测序的原理、步骤、以及N端测序服务的注意事项

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蛋白测序 的主要策略是采用化学或者酶消化方法将多肽链拆分,然后测定氨基酸残基含量和组成。本文详述了蛋白质测序的概念,蛋白测序的步骤以及蛋白N-端测序服务等。

一、概念

当前,所谓蛋白质测序 ,主要指的是蛋白质的一级结构的测定。蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。多肽链的氨基酸顺序,它是蛋白质生物功能的基础。

蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来,现在已经知道约十万个不同蛋白质的一级结构。

二、测定步骤

1 多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子 ,必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起,称为寡聚蛋白质,如,血红蛋白为四聚体,烯醇化酶为二聚体;可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理,即可分开多肽链(亚基).

2 测定蛋白质分子 中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系,即可确定多肽链的数目。

3 二硫键的断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起,可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下,用过量的β-巯基乙醇处理,使二硫键还原为巯基,然后用烷基化试剂保护生成的巯基,以防止它重新被氧化。

二硫键的切割与保护(元素后数字为下标)

a 过甲酸〔performic acid〕 不可逆

-CH2SO3H

b、还原+氧化 不可逆

[ 巯基乙醇,DTT ] + 碘乙酸等

-S-CH2-COOH

c、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

-R1-S-S-R2 + HSO3-

R1-S- + R2-S-SOH3

可以通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力;应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。

巯基(-SH)的保护

作用:这些反应(见下图)可用于巯基的保护。

4 测定每条多肽链的氨基酸组成,并计算出氨基酸成分的分子 比(如下图)

5 分析多肽链的N-末端和C-末端

多肽链端基氨基酸分为两类:N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽链氨基酸顺序分析中,最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法(Sanger法;Edman法;DNS-Cl;酶降解法),C末端分析法(肼解法;酶降解法;硼氢化锂法)。

6 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片,并将其分离开来。

7 测定每个肽段的氨基酸顺序

8 确定肽段在多肽链中的次序。

利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠,拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

9 确定原多肽链中二硫键的位置

一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链,再利用双向电泳技术分离出各个肽段,用过甲酸处理后,将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析,然后同其它方法分析的肽段进行比较,确定二硫键的位置。

三、蛋白质N-端测序服务

几乎所有的蛋白合成都起始于N-端,蛋白质N-端的序列组成对于蛋白质整体的生物学功能有着巨大的影响力。例如N-端序列影响蛋白质的半衰期,同时关联着蛋白亚细胞器定位等,这些与蛋白的功能和稳定性息息相关,对蛋白进行N-端测序分析,有利于帮助分析蛋白质的高级结构,揭示蛋白质的生物学功能。

目前对蛋白N端测序主要分类两大类,其一为非质谱技术,例如经典的Edman降解法、利用反转录RT-PCR得到对应蛋白的cDNA,再来反推得到蛋白序列;其二为质谱技术。各自都有其使用的长处和制约之处,目前,市面上采用的,依然是基于经典的Edman降解法原理,利用美国ABI公司Procise491蛋白序列测序系统进行蛋白N-端测序。

蛋白质N-端测序服务说明

基于Edman降解法原理进行蛋白质N-端测序,从理论上不可避免的受到两种条件制约,会很大程度上影响蛋白测序质量:

1、样品纯度不能太低,经验认为纯度大于90%的蛋白才适用于测序反应。

2、N端封闭或糖基化的蛋白质难以进行Edman反应,无法测序。

蛋白质合成是从N末端开始的,因此分析蛋白质合成是从N末端序列对蛋白序列分析很重要,蛋白质N端序列主要是通过Edman降解法和质朴技术实现的。

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