蛋白质组学

植物基因在大肠杆菌中的IPTG诱导表达

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通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组 蛋白是一个方便快捷的方法.植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上,受噬菌体T7强启动子控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导.当需要表达蛋白时,在细菌培养基中加入IPTG来启动表达.不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列,在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便.

以pET-32a(+)为例,介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组 蛋白的过程,从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程.

1.准备工作(试剂配置和器材准备)

1)操作流程示意图

主要步骤操作

①制备pET-32a(+)载体 用限制性酶消化,去磷酸化后胶纯化回收

②制备插入DNA PCR 装入质粒后进行限制性消化,再回收

③插入片段克隆到pET-32a(+)载体 插入片段与pET连接,转化

④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株

⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE,Western 印迹、定量分析确定目的蛋白

⑥放大试验纯化目的蛋白 放大试验,制备粗提物,亲和纯化,切除融合标签

2)配制生长培养基如LB,和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液.

3)宿主菌的保存.长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中.

4)感受态细胞的制备,参照其它试验手册.

2.操作步骤

[1] 制备载体

1)载体消化和胶纯化

3μg pET载体

3μl 10×限制性内切酶buffer

10-20U 两种酶(是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%)

3μl 1mg/ml乙酰BSA(根据需要

补足水到30μl

2)37℃温浴2-4h

3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度

4)消化完全后,加入0.05U小牛碱性磷酸酶,37℃ 30min

5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳,切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段.

6)-20℃保存备用.

[2]制备插入片段

限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法.一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因,克隆进T-载体,然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收.但在PCR过程中,需要减少突变的发生,可采用高保真酶,尽量减少PCR循环次数,增加模板和引物的浓度.

[3]在pET32a载体中插入片段

连接反应

2μl 10×连接buffer

2-5μl 50ng/μl 预制的pET32a载体

1μl T4连接酶

5-7μl 预制目标基因插入片段

加水到20μl,枪头混匀,16℃反应2h-过夜

[4]转化

转化方法同T-载体转化大肠杆菌DH5α一样,既可转化BL21也可转化DH5α,若转化DH5α,需要重新抽提质粒,再转化BL21.筛选LB平板需含50μg/μl 卡那霉素.

[5]pET重组子鉴定

如果亚克隆成功,阳性菌落数远大于阴性菌落.检验转化子的方法很多,包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序,体外转录和翻译.

[6]DE3溶原菌的诱导表达

(1)、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液体培养基中,37℃培养至OD600为0.4-1.

(2)、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM(T7启动子)或1 mM(T7lac启动子),继续培养2-3小时.

(3)、将摇瓶置于冰上5min,5000g 4℃离心5min收集菌体.

(4)、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl (pH8.0)中,离心.

(5)、除去上清,菌体保存于-70℃或继续纯化.

[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析

(1)、机械破碎细胞.一般用弗氏压碎法或超声波处理.

(2)、裂解液14000g离心10min,分离可溶和不溶部分.

(3)100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上样buffer和水.85℃迅速加热3min使蛋白变性,然后上样进行SDS-PAGE分析,观察蛋白表达.

(4)若目标蛋白在不溶部分中,需进行包涵体纯化.750μl20mMTris-HCl,pH7.5重悬沉淀,离心10000g5min,除去上清重复洗涤.然后1.5ml 1%SDS上样buffer中重悬沉淀,重复(3)的步骤进行SDS-PAGE分析.

3.总结(注意事项)

(1)所有操作尽量在冰上操作,以避免蛋白质发生变性;

(2)根据自己的需要选择不同的表达载体,并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因,其中有些标签是可以去除的.

(3)构建好的载体最好进行测序验证,保证读码框正确,即没有移码.

(4)长期保存的pET重组子在高浓度甘油(19%)中会导致质粒不稳定.

(5)T7lac启动子是严谨启动子,IPTG诱导时可以优化最佳浓度(25uM-1mM之间)使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性.

(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体,而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白.在某些情况下,低温(15-20℃)延长诱导时间(过夜)可以使溶解性蛋白的产量达到最大.

(7)进行SDS-PAGE分析时,需优化电泳上样体积.

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