蛋白质组学

GST融合蛋白的表达与纯化的原理与操作步骤

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GST融合蛋白的表达与纯化原理

GST 纯化系统是利用GST (glutathione-S-transferase )融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和,通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化 。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白,并可反复使用数次。试剂u IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) 2g IPTG 溶解入10ml 水,过滤除菌,分装,-20℃保存。u Lysis buffer (50ml)1)2.5ml 1 M Tris,pH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione 2)10 ml 1M Tris,pH8.0 3)90ml distilled water .

GST融合蛋白的表达与纯化操作步骤

1)挑一个克隆 至2ml LB液中(Amp+ )

2)37℃振摇至OD600值约为0.6

3)将2ml菌液加入100 ml LB中

4)37℃振摇至OD600值约为0.6

5)加入IPTG至终浓度为1mM

6)继续摇3~4h

7)离心(5000 rpm,5min,4℃)

8)用10×柱体积的lysis buffer悬浮细菌

9)超声破碎细胞

10)离心(12,000rpm,15min,4℃),取上清

11)用滤纸过滤

12)加0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱

13)5×柱体积的lysis buffer洗层析柱

14)样品过柱

15)5×柱体积的lysis buffer洗层析柱

16)3×柱体积的elution buffer洗脱蛋白

17)收集蛋白:0.5ml/管 18)取20ml样品SDS-PAGE鉴定可以在buffer里增加点蛋白酶抑制剂,防止蛋白的降解。

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