蛋白质组学

T7 Select噬菌体展示系统的优越性及其常见问题

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Novagen在T7噬菌体的基础上研发出T7Select™ 噬菌体展示系统产品。该系统具有以下几个优点:1.复制所需要的时间短;2.细胞质中的蛋白可以进行组装;3.产品使用便捷;4.产品的保存简单方便;5.克隆产量高;6.T7噬菌体的独特优点。这些特点都使得T7Select代替了M13系统,成为构建文库 和进行亲和淘洗一个更加优越的选择。

该系统以多种产品形式提供,包括T7Select噬菌体克隆 试剂盒,包含OrientExpress™ cDNA合成的试剂盒以及T7Select噬菌体克隆系统。

另有12种预制人正常组织和病理组织来源的cDNA文库提供,这些文库都是用T7Select10-3载体 构建的。

T7噬菌体展示系统与M13系统有什么区别?

M13和T7噬菌体最大的区别就在于成熟病毒从宿主细胞中释放的方式不同。M13噬菌体在周质中组装,必须经细胞膜分泌;而T7在细胞质中完成组装后直接从细胞裂解出来。因此,任何抑制分泌过程的蛋白和多肽都不能在M13系统中展示,或展示效果很差。例如,具有带电荷氨基酸残端的疏水蛋白、肽或多肽等,会因穿膜困难而无法展示。T7文库 则不受这种序列限制,而且,一般来说T7展示系统表达蛋白或多肽的种类要比M13这样的丝状噬菌体更多。

T7比M13优越主要还是表现在易于操作、表达能力以及亲和淘洗富集等方面。T7虽然要求体外包装但生长极为迅速。T7噬斑形成仅需3小时,比M13系统节约整整1天。M13则在测序 方面比T7更方便。

T7噬菌体极为稳定,能在各种严酷的条件下不被破坏,而其它噬菌体常在亲和淘洗的过程中失去活性。因此,在T7系统的结合/洗脱过程中,可选用的试剂种类较广泛,亲和淘洗后噬菌体仍然保持很高的感染活性。

产品应用

许多基于多肽或蛋白功能来获得其编码cDNA的研究多可以选用噬菌体展示技术,例如:

蛋白相互作用 (例如激素,抗体,受体)

酶分析, 酶抑制

核酸-蛋白相互作用

抗原决定簇作图

突变分析

常见问题与解答

Novagen的人cDNA预制文库是怎么制备的?

Novagen的预制T7Select cDNA文库均以T7Select10-3b制备,材料是经 Novagen的Straight A’s™ mRNA分离试剂盒两次纯化的mRNA。mRNA最长达8 kb以上,经反转录,用Novagen的OrientExpress™ Random Primer cDNA Kit (带甲基化dCTP)克隆。原始库的重组子为>1 x107 pfu,文库的滴度最低为1 x 1010 pfu。所有文库仅经一次包装和扩增。

哪一种Novagen的T7噬菌体载体(T7Select1-1,10-3,1-2或415-1)最适合我?

T7Select1-1和T7Select10-3载体适合用于构建cDNA文库和PCR克隆 – 能确保产物均为同一阅读框。作为cDNA载体,由于是定向克隆,所生成的带正确阅读框的转录产物较之非定向克隆方法多1倍。如果采用非定向克隆策略,则获得按正确阅读框表达的多肽或蛋白的几率会下降一半,即为克隆总数的1/6 。

T7Select1-2载体用于从单一cDNA克隆展示蛋白或多肽。因此, cDNA 插入子在T7Select1-2载体上可有3种阅读框供选择。

亲和淘洗有什么好处?

亲和淘洗用于检测有蛋白或多肽参与的相互作用非常有效。如果目的序列的配合基被纯化和组装,即可用多肽或蛋白库与之反应(通常在柱子或96孔板上进行),检测其结合情况。“捕获”的完整噬菌体经洗提、扩增,再经2至3次这样的富集,即可在很短的时间内一次完成药物或纯化的受体与为数众多的多肽或蛋白的结合分析。采用这种方法进行配合基(如信号转导中间体区域)结合区作图也是可行的。

cDNA在lambda载体表达与T7Select亲和淘洗有什么不同?

确切地说,亲和淘洗是一种选择方法,而非仅仅只是一种筛选方法。亲和淘洗可以直接发现和“捕获”表达目的多肽或蛋白的噬菌体,这种富集操作较之传统的lambda噬菌体或质粒筛选优势十分显著。

为什么T7Select C-端融合很重要?

将目的序列克隆到T7Select载体基因10 的C-端可以使含有终止密码子的插入序列得以表达和展示。M13只能进行N-端融合,而N-端融合容易发生移码错误。

经过3-4轮亲和淘洗富集后,噬菌体的纯度能够达到多少?

每种目的产物的KD (亲和性)都不一样,用户可以参考T7Select产品操作手册TB178 (“亲和淘洗次数”部分),经计算估计富集程度。T7Select阳性对照裂解物可作为参考指标,但仅供作为目的产物的参考。T7Select阳性对照裂解物可以作为标准参考,但不作为目标产物的直接判别依据。当 T7Select阳性对照裂解物与没有插入片段的噬菌体(T7Select阴性对照裂解物)以1:106–1:107结合,同源阳性噬菌体经过3或4轮亲和淘洗即可在S-蛋白包被的ELISA板上富集。S-蛋白包被的ELISA孔结合活性约为108–109 pfu,超过这个数值的噬菌体则不能被结合。

我已经做了3-4轮亲和淘洗富集,接下来该怎么办?

建议在经过3-4轮亲和淘洗后对几个噬菌体DNA克隆进行测序。最好对目的序列邻近的序列也进行分析,这有助于确定相关特征信息。阳性克隆可以亚克隆到合适的pET载体上表达、纯化及检测目的产物。

T7Select系统能表达足够的蛋白用于plaque lifts?

低拷贝表达通常难以用Western分析检测到;只有高拷贝表达的蛋白和多肽可以检测。

T7会侵染其它实验材料吗?

T7噬菌体也具有一般是具体的特征,也会去感染其他的宿主。但是,由于它本身的结构决定,这些宿主必须具有T7基因10壳蛋白的表达。所以,噬菌体大规模扩撒的危害性就很大程度上减小了。

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