蛋白质组学

毕式酵母表达常见的问题及其解析

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1、问:我用毕式酵母表达一个27KD的蛋白,小量表达并做SDS-PAGE有一条类似三聚体的条带。用大量表达,表达上清用镍柱进行亲和层析 ,在FPLC上可以看到一个大峰,但跑电泳却没有发现条带,为什么呢?请赐教

参考见解:你在大量表达后有没有跑电泳检测?表达上清用镍柱亲和层析 后洗脱液有没有电泳检测?你首先要做的是:1,确定你的蛋白确实有表达;2,亲和层析是表达的蛋白确实被洗脱下来了.然后再考虑FPLC的事.

在FPLC上可以看到一个大峰,但跑电泳却没有发现条带,可能的原因有:1,上样时没有目的蛋白,可能是1)没表达2)亲和层析 时没洗脱或是穿透了;2,目的蛋白结合在FPLC柱子上没被洗脱;3,目的蛋白穿透FPLC柱子,你在FPLC上看到的大峰可能是盐分峰;4,电泳时没跑好,目的蛋白没被检测到.

FPLC大峰也可能是目的蛋白峰,它的吸收值有多少?不要看与基线相比的高度,要看吸收值,如果吸收值不高的话就是蛋白的浓度太低,浓缩后再跑电泳。

2、问:我现在做的是裂殖酵母表达,表达载体 pesp-2,酵母菌珠sp-q01.说明只提供用化学转化法,但我转化了好几次都没有结果,是否也可以用电转化,在多克隆位点把质粒线性化?

参考见解:其实无论是那种类型的酵母表达,转化方法基本是一制的。

化学转化法对酵母转化讲就不是很高,这里你可以用电转的。查一下以前别人的讨论,看看电转化方法,效率提高了,筛选的希望就大些了

由于筛选表达酵母的时间比较长,两个方案同时做应该来的及的

至于线性化,对于电转是要做的步骤,这是为了后面定位重组 整合。

3、问:我做毕赤酵母分泌表达,想问做阴性对照的是应该用加甲醇前的上清还是用一直不加甲醇摇瓶同样时间的上清呢?

参考见解:对于阴性对照我一般都用转了不含基因的原始质粒(比如9K等)的菌作为对照,诱导过程中同样加入甲醇,诱导的时间均一样,每次样品都会有一个对照。

阳性对照可以用以前表达的比较稳定的蛋白的工程菌充当。

4、问:请教各位高人:我用G418筛转化有多拷贝的细胞株,筛了两次,四个梯度0.5mg/ml,1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml.结果都没长出细胞,空载体对照也没长出。载体是pPIC9K。我用电转,涂于MD固体培养基,发现转化效率较低,每块板长出十几个点,是否是转化效率低导致的?谢谢指教!

参考见解:不知道你的转化条件是否得到优化?我认为您是否可以从以下几点入手:

(1)挑取酵母单菌落,接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中,30℃、250~300r/min培养过夜;取100~500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中,28~30℃、250~300r/min培养过夜,至OD600达到1.3~1.5。

(2)电击后马上加入1ml冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体混匀。

(3)推荐:电压1.5kV;电容25μF;电阻200Ω。电击时间为4~10msec。

5、问:在下是初学者,关于毕赤酵母的诱导表达有些问题:

“每24h 向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5 ~1.0%”这里的甲醇浓度如何控制?

还有,关于BMMY的甲醇浓度有些材料里的是0.5% ,有的是1.0%,应该是哪个?“每24h 向培养基中添加100 %甲醇至终浓度为0.5 ~1.0%”这里的甲醇浓度和BMMY中的甲醇浓度是要一致的吗?

另外一个小问题,配10%甘油时,移入量筒的100%甘油一部分会粘在管壁上,难免最后配成的10%甘油会有所偏差,这样要不要紧?操作上是否有问题?

参考见解1:“每24h 向培养基中添加100 %甲醇至终浓度为0.5 ~1.0%”

可以给你解释一下:

(1)它的意思是每隔24小时,不断的添加纯甲醇(指的是甲醇试剂含有100 %甲醇,不含有其他的成分)至终浓度为0.5 ~1.0%,指的是添加的甲醇占总体积的0.5 ~1.0%(即每100升培养基含有甲醇0.5 ~1.0升,如果是质量体积比则是每100毫升培养基含有甲醇0.5~1.0克)

(2)只要你添加的量在以上的这个范围就可以,当然可以根据实验的实际情况进行调整,但是一般要在此范围内。

(3)配10%甘油时,注意先加入部分水后在称取甘油加入,然后在定容到所需要的体积,这样就可以避免甘油粘在管壁上,甘油易溶于水,配好后,再粘在管壁上就不会影响了。

(4)建议你对实验的基础知识多多学习,你会又很大进步的!!

参考见解2:

(1)如何确保加入后甲醇浓度在此范围内?你可以进行检测啊!只要检测你的培养基中剩余的甲醇含量即可,可以计算出你应该加多少甲醇,24小时可以检测一次。

(2)至于为什么24小时加一次,具体原因我不是很清楚,但是我觉得应该是发酵中(尤其是发酵瓶)培养基的体积太小,不能太多的取样,取样太多会影响体积、蒸发量、无菌等指标的。而且在这个时间内酵母在甲醇终浓度为0.5 ~1.0%中生长在其许可范围内,其甲醇消耗不会超过这个范围的,时间安排也比较合理,所以可能是个经验值吧!!其实不需要考虑甲醇的消耗,只要检测它的剩余即可,根据剩余可以计算出你需要加入的甲醇体积或者质量。

(3)另外你不一定一次就加入,可以连续的在24小时加入,不过操作就非常麻烦了,发酵罐还可以,摇瓶怎么办呢!!

(4)至于一定时间从中取出1ml,这个变化应该不需要要计算进去的吧,你取样的浓度和你培养基里面的是一样的,如果这考虑进去的话,那么蒸发量、两种液体混合的体积变化、湿度等等你也要考虑,就太繁了,他们的影响很小的,没有必要计算在内。

6、感受态制备关键点:

甘油的质量,水的质量,最好是miniQ的,如果要求完美,洗瓶不要有洗涤剂残留,先将瓶装满miniQ水高压,再弃去,再配置10%甘油。收菌以半对数期合适,一般OD0.5收菌,过则不佳,直接取-80度菌种摇,次日转种,从盘上菌落摇的要差,33-34度摇菌结果更理想。在以冰冷10%甘油等量,半量,1/4量洗涤时一定低温,重悬时应轻震荡,弃洗涤液应倒干静,那怕损掉部分细菌。最后大概500ml能做3-4ml感受态,液氮中冻10min转-80度冰箱,快一点,免的EP管爆了,也可不冷冻,直接用来转化。感受态应以标准浓度质粒电转记算效率,一般大于10的9方每mg,操做以1ng/ul质粒1ul加40ul感受态置0.1杯,电转后以最快的速度加入1mlsoc复活,100-150转摇1hl,取1/1000铺盘应大于1000个菌生长。这样用于建库工作才行。电转时质粒或连接物尽可能少,以减少离子,实际上离子高,电流直接通过,没有场强,质粒是进不去的。

总结:

(1)任和有关东西都要干净,保证没有离子,

(2)从接触甘油开始就保持恒0度,

(3)电击后复活要快。

不过上面的确麻繁,理解加手熟就能达到,最后效率和菌种有关,一般能达到10的9方,有的能达到10的10方。不过现在我做普通转化就不麻繁,过夜菌彻底用EP管小离心,常温10%甘油洗干净,重悬后做电转,用LB或SOC复活立刻铺盘,只要洗的干净,还没有克隆转不出来的,半h就搞定了,只是每次都要鉴定,因为电转杯是反复用,怕别的残留污染。

7、问:转化了一个基因到毕赤酵母,蛋白有表达,但pcr无论如何也检测不到阳性的特性条带,该如何改进,请指点

参考见解:本人曾经遇到过同样情况,后来发现,提取酵母DNA当模板时,不能按操作手册说明的模板的用量进行PCR,而应该降低模板的用量,一般在ng水平已足够。譬如,挑取单菌落于3mL适宜培养液中,摇菌过夜,用试剂盒提取酵母DNA,取1uL提取产物作为模板进行PCR鉴定已足够。

参考步骤

(1)直接用枪尖或者牙签取单克隆到10ul无菌去离子水中;

(2)加5ul5u /ul的溶细胞酶(SIGMA);

(3)37度孵育30分钟;

(4)-70度15分钟;

(5)煮沸5分钟;

(6)12000转离心5分钟;

(7)取上清5ul到50ulPCR反应体系。

我这样做的,做了几十个克隆都做出来了。

8、问:表达3KD左右的抗菌肽,可是电泳没有目的蛋白,表达小肽有哪些注意的方面?请赐教!!

参考见解:首先确定你的蛋白是不是没有分泌.看看菌体蛋白中有没有,如果没有的话:

第一、构建多种分泌表达载体,看看各种表达载体因素如载体整合方式,整合拷贝数,5'非翻译区及甲醇利用表形对表达量得影响.

第二、一般来说发酵灌较摇瓶培养表达量更高(10-20倍).

第三、选用酵母偏爱密码子.

第四、选用蛋白酶缺陷型得宿主菌如SMD1168等.

9、问:最近在毕赤酵母表达了一个42KD的蛋白,用的是pPIC9K载体,设计的是分泌表达,但在上清的ELISA检测一直未检测到表达(ELISA系统很正常),而用GFP 作报告基因的融合蛋白质似乎有表达,有几个问题想问一下:

(1)蛋白质的RNA结构能是383Kcal/mol(用DNASIS),不知道是否对表达量有多大的影响?

(2)目标蛋白质大约含33%的疏水氨基酸,在a-factor后的10个氨基酸(即基因开头的10个氨基酸)都是疏水性的,是不是对分泌表达有影响

(3)在pPIC9K 有KOZAK序列吗?如果没有KOZAK序列,怎样在加入KOZAK序列而保证不产生移码,不影响目标蛋白质的功能?

参考见解:前面两个问题我是回答不清楚的,大家知道影响分泌表达的因素主要还是你的目的基因,但究竟是目的基因的哪个方面,是氨基酸序列,分子量,我想都是,但具体是怎样的需要阅读一些文献,不过也不一定有答案,那本手册上说了一些,但要解决你的问题似乎根本不够,按目前毕赤酵母分泌表达看,分泌是一个限速步骤。而且分子量大的蛋白分泌更加困难,那分子量在哪个位置才是界限呢,需要将现今毕赤酵母分泌表达的基因作一个总结,应该有收获的!

第三个问题,关于pPIC9K 是否有KOZAK序列,呵呵,KOZAK序列是真核生物所特有的,相当于原核中的SD序列,但不知道对于低等真核生物毕赤酵母而言,意味着是一个怎样的序列,不过不要紧,这样的与启动翻译相关的序列一定在这个载体上有的,总之翻译的时候是从信号肽的起始密码子ATG开始翻译,所以要保证你的信号肽后面的目的基因序列阅读框的准确性!!!

10、问:用毕赤酵母表达系统,分泌表达,在用KEX2酶切割a-factor时出现点问题,我的蛋白第一个氨基酸是脯氨酸,后来才知道脯氨酸影响KEX2切割,请问有什么办法解决吗?最好能提供相关方面的参考文献,谢谢

参考见解:我的建议是你最好重新构建你的重组表达载体。

在构建的时候,最好用载体上a-factor之后的多克隆位点中的第一个酶切位点,这样的话,最多也就是引入了一两个外来氨基酸,当然如果你运气够好的话,没准正好可以利用密码子搞出来个酶切位点。这样就不会有切不开的情况了。我用的就是pPICZaA载体的EcoRI位点和XbaI位点将我的目的片段插入载体,现在蛋白分泌表达的很正常,而且我也进行了蛋白质氨基酸测序证明酶切的很彻底!连两个Ste13都给切开了。祝好运!

11、问:我做的是毕赤酵母工程菌5升罐子发酵,用50%甘油补料8小时,共补料114毫升,但是补料完后经过8,9个小时,溶氧始终都上升不到100%,表示甘油还没耗完,甘油没耗完就不能加甲醇进行诱导,我做了几批都是这样,请问这是怎么回事呢?请各位高手指点,谢谢!!!

参考见解:甘油补料速率太慢,根据我做30升罐的数据,50%的甘油量应控制在100毫升左右,在四小时内补完,然后饥饿30分钟到四十分钟,即可开始少量流加甲醇让菌体慢慢适应甲醇的环境,并不需要像楼主所说的那样非得等到溶氧上升到100%这个硬性指标,因为少量的甘油存在时,酵母会优先利用完甘油,然后再利用甲醇,已经有文献报道在毕赤酵母发酵过程中流加甘油和甲醇的混合物,使一部分细胞利用低浓度的甘油进行快速的增殖,而因为甘油浓度较低又不影响其他细胞对甲醇的利用进行表达。像你补完料后8--9小时还不开始补加碳源,细胞早就饿死了。

12、问:我用毕赤酵母表达一个1269bp的基因,用的是分泌型表达载体 pPICZαA,但是电转化后,提取酵母基因组PCR鉴定只出现一条大约1800bp的条带,没有出现2200bp带,为什么?通过MDH、MMH平板鉴定均是Muts型,而且诱导后上清里边没有任何蛋白,反而在沉淀里边出现了一条将近70KDa的很明显的蛋白,与预期的58KDa相去甚远,不知道为什么?

参考见解:稀有密码子应该不会影响你的蛋白分泌的,影响最大的还是你表达的蛋白的二三级结构和二硫键复杂程度以及特殊的修饰

从你说的情况看,蛋白已经在胞内大量表达了,只是没有有效分泌到上清中

酵母对蛋白的二硫键加工和糖基化等修饰处理不是很强,所以不是所有蛋白都能在酵母系统中有效表达,尤其是分泌表达的!

可能是因为你的蛋白太大,二硫键太多,还有糖基化位点,导致a-factor信号肽不能有效引导你的蛋白分泌到上清中。

你可以试试带有其他的信号肽的载体如pHIL-S1载体或pGAP载体,或者用你的蛋白自身的信号肽(如果你的蛋白本来就是分泌型蛋白的话)。

有可能其他的信号肽也不能有效分泌你的蛋白,就得考虑其他的表达系统了

13、问:有谁用毕赤酵母成功表达过大小为50多个AA的多肽?我用的质粒和菌株分别是pPIC9K, GS115。我担心这么小的片段能否表达出来。请告知,谢谢!

参考见解:270bp长度的DNA大约编码10kD的蛋白质,你的核酸为150bp,它所编码的蛋白质肯定在10kD以下,而12%的SDS-PAGE可以分离10-50KD的蛋白质,那么你至少用18%或20%的SDS-PAGE。如果你怕溴芬蓝指示剂遮盖了你的蛋白质,那么你可以用银染观察你的电泳效果。

14、问:用毕赤酵母表达蛋白(非表达分泌型),经常会遇到表达量挺高的,但破完细胞后发现目的蛋白都在沉淀中没法往下纯化,请问这是为什么?如何才能将蛋白在不变性的情况下溶到上清中?

参考见解:表达量高的话,表达的蛋白很容易出现不正确的折叠而形成不溶性的产物,因此要提高可溶性蛋白的表达量,最好不要让目的基因过量表达。可采取一些诸如降低温度等的措施。至于将表达的不溶性的产物溶到上清来而不将蛋白变性,大概目前至少我没有看到这种技术,但是你可以变性后再复性。

15、问:在甲醇诱导初期,pH略有上升,几小时后pH下降,这应该算正常,可是它降幅不大,后又有所上升,溶氧也上去了。加大甲醇流速或关闭一段时间,也没发生什么变化,镜检,无染菌,细胞也没染色,说明正常,测OD,没增加;加几毫升甘油,就发现pH下降,溶氧也迅速下降。这是不是因为诱导初期甲醇加过量了,导致酵母菌对甲醇有抵制作用,吸收利用速度过慢?还是由于其他的原因?

参考见解:你用的是什么菌种,是Mut+orMut-,诱导表达初期甲醇的加入量要缓,以让菌种适应从甘油为炭源到以甲醇为炭源的变化,甲醇毒性比甘油毒性大,在发酵培养基中不可超过2%,如你的菌种为Mut+可按3.6ml/h/L发酵液加入甲醇,适应2-4h后,提高加入量。如菌种为Mut-可按1ml/h/L发酵液加入甲醇,适应2h后,每30min再提高加入量最终维持在3ml/h/L水平。

补甲醇时一定要监测do值,以防过量,方法是停补甲醇后1min内DO应上升10%否则应减慢补甲醇速度速度。

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