蛋白质组学

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蛋白样品的获得主要包括破碎法、沉淀法、蛋白溶解等,可以根据实验目前选择最合适的方法,本文主要总结了蛋白抽提的仪器和材料的准备,试剂溶液的配制以及具体的操作步骤。

蛋白提取方法

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织和细胞的

1.1.2 仪器设备

机械组织匀浆器

低温高速离心机 (>40,000 g)

超速离心机

超生细胞破碎仪

超纯水装置

1.1.3 试剂

三氯醋酸 (TCA)

丙酮

二硫苏糖醇 (DTT)

尿素

CHAPS

PMSF

EDTA

乙醇

磷酸

考马斯亮蓝R350

抑肽素A

亮肽素

试剂纯度均应是分析纯或以上。

1.1.4 溶液配制

(1) PBS

NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pH至7.4,用纯水定容至1 L;

(2) EDTA 储存液:

18.61 g Na2EDTA•2H2O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒),定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用;

(3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml,100×)

10 mg/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ml储液,-20℃保存;

(4) 抑肽素储存液 (70 μg/ml,100×)

1 mg/ml溶于甲醇,-75℃保存;使用时配成70 μg/ml储液,-20℃保存;

(5) PMSF储存液 (10 mM, 100×):

17.4 mg PMSF,溶于1ml异丙醇中,-20℃ 保存。

DTT 储存液 (1 M):

0.31 g DTT溶于2 ml H2O中,-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。

(7) 裂解液:

Lysis buffer A

(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer B

(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer C

40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O

Lysis buffer D

(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)

Lysis buffer E

(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer F

100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)

●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。

蛋白酶抑制剂混合物[3]

成分 终浓度

蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mM

EDTA 0.3 mg/ml (1 mM)

抑肽素 0.7 μg/ml

亮肽素 0.5 μg/ml

1.2 方法

1.1.1组织蛋白提取方法

1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1]

(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步;

(2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织;

(3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸(w/v)的丙酮溶液中;

(4)蛋白–20℃沉淀过夜;

(5)35000×g(6℃)离心30min;

将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中;

(7)-20℃放置1h;

35000×g(6℃)离心30min;

(9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥的沉淀;

(10)在裂解液中重新溶解沉淀(50-100mg组织需要1ml裂解液);

(11)15℃,40000×g,离心1hr;

(12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度,分装后置–75℃保存。

1.2.1.2超速离心法

(1)取材;

(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末,每1g样品加入0.5ml裂解液,使用组织匀浆器匀浆30s;

(3)组织悬液15℃,10000×g离心10min;

(4)上清液4℃,150000×g超速离心45min;

(5)小心避开上层漂浮的脂质层,吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min;

取离心上清。Bradford法定量,分装后置–75℃保存。

1.2.2培养细胞蛋白提取

1.2.2.1循环冻融法

(1)吸出培养液弃去,0.01mol/LPBS洗一次;

(2)加入PBS,用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中;

(3)500×g,离心5min;

(4)弃上清,PBS洗三次(室温,500×g,5min),

(5)在离心管中加入1mlPBS,重悬细胞,用1ml微量加液器移入Eppendorf管中;

执行Biofuge存储程序8,500×g5min离心;

(7)用200μl微量加液器吸出PBS,弃去;

吸干残留的PBS,估计样品体积,加入5倍体积裂解液,巴氏滴管混匀,液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3s,室温融化),DTT在第一次冻融后加入;

(9)执行Biofuge存储程序6,15℃,40000×g,离心1hr(Biofuge);

(10)上清Bradford法定量,沉淀-75℃保存备用。

1.2.2.2超声破碎法

(1)取对数生长期的细胞,吸出培养液弃去,0.01mol/LPBS洗一次;

(2)加入PBS,用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中;

(3)室温,500×g,离心5min;

(4)弃上清,PBS洗3次(室温,500×g,5min);

(5)在离心管中加入1mlPBS,重悬细胞,用1ml微量加液器移入Eppendorf管中,500×g离心5min;

吸干残留的PBS,估计样品体积,加入5倍体积裂解液,混匀,移入1.5mlEppendorf管中,冰浴中以最大功率超声破碎细胞(3×10s);

(7)15℃,40000×g,离心1hr(Biofuge);

上清Bradford法定量,沉淀-75℃保存备用。

2.结果和讨论

蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。

我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法;破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。循环冻融法操作简便,比较适合提取培养细胞的稳定蛋白,我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度,即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性,同时要注意散热。匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小,所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法,我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法;由于神经组织比较柔软,液氮研磨法也很适合,本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织,中枢神经组织由于富含脂类,沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离,但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。高速离心的缺点是需要样品量大,如BeckmanL7-65超速离心机的离心管容量为8ml,不适用小量样品的制备。

在众多的裂解液配方中,我们主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物,原因是这一配方经长期使用很稳定,裂解效率也较高,非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用,高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度,尿素就容易析出,影响蛋白的溶解),过量的去污剂也可以减少脂类的污染,两性电解质可以提高蛋白的溶解度,同时有利于等待聚焦。早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解,但是由于盐离子的引入,导致IEF电压过低,影响聚焦。

蛋白抽提纯化过程中务必保证实验的试剂、仪器等整个实验过程中没有蛋白酶的作用,一定要抑制蛋白酶的活性,可以通过加入苯甲基磺醯化氟PMSF和AEBSF抑制苏氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶活性、加入EDTA抑制金属蛋白酶活性,高的pH可以抑制大多说蛋白酶活性。、

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