蛋白质组学

原核表达(原理、材料与实验方案)

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一、原理
1、 E . coli 表达系统
E . coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E . coli 菌株以后,通过温度的控制,诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质,将表达样品进行SDS-Page 以检测表达蛋白质。
2、 外源基因的诱导表达
提高外源基因表达 水平的基本手段之一,就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段,以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表达。
不同的表达质粒 表达方法并不完全相同,因启动子不同,诱导表达要根据具体情况而定。

二、材料
1、诱导表达材料
( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基
酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g
NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%
蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
适用范围:大肠杆菌
( 2 ) IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ℃ 保存。
( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液:
50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
50 mmol / L DTT
2 % SDS (电泳级)
0.1 % 溴酚蓝
10 % 甘油
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
1 )酶溶法
(1)裂解缓冲液:
50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
1 mmol / L EDTA
100 mmol / LNaCI
(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )。
(3)10 mg / mL 溶菌酶。
(4)脱氧胆酸。
(5)1 mg / mL DNase I。
2 )超声破碎法
( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液:
100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 % 溴酚蓝
20 % 甘油

三、实验方案
1、外源基因的诱导表达
( 1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。
( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定,
确定无误后进行下一步。
( 4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 ℃ 培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6 ,迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。
( 5 )取上述培养液1 mL , 1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测。
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 )细菌的裂解
常用方法有:① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为:
① 4 ℃ ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL )。弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀。

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