蛋白质组学

纸层析法:分离鉴定氨基酸实验

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纸层析法是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。本文主要介绍了纸层析法分离鉴定氨基酸的实验原理、器材和具体操作步骤。
 

纸层析法

一、目的

通过氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。

二、原理

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

层析溶剂由有机溶剂和水组成。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf 值(比移)来表示的:

R=原点到层析点中心的距离

原点到溶剂前沿的距离

在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、器材

1、层析缸① 2、毛细管3、喷雾器4、培养皿

5、层析滤纸(新华一号)

四、试剂

1、扩展剂

是4 份水饱和的正丁醇和1 份醋酸的混合物。将20mL 正丁醇和5mL 冰醋酸放入分液漏斗中,与15mL 水混合,充分振荡,静置后分层,放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL 置于小烧杯中做平衡溶剂,其余的倒入培养皿中备用.

2、氨基酸溶液0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0.5%)。各5mL

3、显色剂50~100mL

0.1%水合茚三铜正丁醇容液。

五、操作

1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。

2、取层析滤纸(长22cm、宽14cm)一张。在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔划一条直线,在此直线上第间隔2cm 作一记号如右图。

3、点样用毛细管将各种氨基酸样品分别点在这6 个位置上,干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。

4、扩展用线将滤纸缝成筒状,纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿建迅速置于密闭的层析缸中,并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面需你于点样线1cm)。待溶剂上升15~20cm 时即取出滤纸,自然干燥或用吹风机热风吹干。

5、显色用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后置烘箱中烘烤5 分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。

6、计算各种氨基酸的Rf 值。

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