蛋白质组学

酵母双杂交实验常见问题及其解决方法

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1.如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的,该怎么办?

在某些情况下,在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆 于1ml的SD/–Trp,接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板,在30℃下温浴,直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每块板上的克隆,并收集到一管中,这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

2.如果诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达,该如何处理?

该蛋白很可能有转录 激活域,是个转录因子。可以通过基因重组切掉转录激活域,然后重新检测其是否自激活,但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

3.转化效率太低怎么办?

可以采用以下方法解决:

1)检测一下DNA的纯度,如果可以的话,重新用乙醇纯化。

2)DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。

3)不适当的培养基,重新配制培养基,并做对照转化。

4)检测pGBT9对照载体的转化效率,放置于SD/–Trp平板上,转化效率应该在1 x105 colonies/mg DNA以上。

4.杂交效率不高,该如何处理?

在杂交中,预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时,应挑选大的、新鲜的克隆进行培养,经过离心和重悬后,再使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1 x109/ml。

一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性,同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂 平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。

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