蛋白质组学

DEPC太危险了 还是蛋白酶K吧

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当大家都全副武装,冒着生命危险使用致癌的DEPC时,是否有想过,其实,还有更安全环保的替代品——蛋白酶 K 的妙用,那么蛋白酶 K 的威力何在,使用过程中该注意哪些方面呢?本文从互联网上摘得不少资料,希望能对大家有帮助。

(不过有一点还是要声明,我没有使用该方法制备的水用于溶解 RNA。原因不是在于我对该方法的担心,而是我没有制备高纯水 (Millipore 水) 的设备。与保存及酶反应有关的水,除了酶的残留是一个考虑因素外,水的纯度也是我考虑的;这种用途的水,我使用的是 Sigma 进口的无酶的 Millipore 水 (也不是 DEPC 处理的水)。我的用途很特殊,首先要求最高纯度的水,所以我只能付出更大的代价。)

看这篇东西,我不知道大家的最大担心是什么;最早我的最大担心是蛋白酶 K 的“尸体”是否会对后续实验产生影响。做过的实验证明我的担心是多余的。

蛋白酶 K,威力巨大的广谱蛋白酶,95C 加热10 分钟,则完全失活。数年前首次使用它替代 DEPC 处理 RNA 抽提用的离心管和枪头,效果不错;后来又用于处理 RNase-Free的水,效果也是一级棒。从此就再也不用 DEPC 了。现在将它的细节公开,与大家分享。

配制 RNA 裂解试剂时,直接用灭菌的双蒸水配制,最后,加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀,室温放置 15 分钟后即可。

枪头及离心管去除 RNase:先将枪头及离心管清洗干净后,移入预先混好的含 1ug/ml 蛋白酶 K 的双蒸水,彻底浸入。室温放置 30 分钟后,连水一起高压灭菌。弃水后,烘干即可。

RNase-Free 水的获得:直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀,室温放置 15 分钟后,灭菌处理即可。该蛋白质的残留对后续实验没有可见的影响。

无蛋白质残留的RNase-Free 水的获得:这比较麻烦。直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀后,倒入专用的蒸馏器中。放置 15 分钟后,加热蒸馏,流出的就是无蛋白质残留的RNase-Free 水。要提醒的是,该专用蒸馏器头几次流出来的水,只能当普通蒸馏水用,因为通道中难确保 RNase-Free 的环境;另外,一定要主要密闭性,否则,流出的水又被污染了。

提示:蛋白酶K可以用户各种蛋白质的消化,因此在提取RNA时完全可以替代有毒的DEPC水,蛋白酶K的最佳使用PH为7.5-8.0,酶活性大于30U/mg,适宜温度为65度。

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