蛋白质组学

凯氏定氮实验的原理与方法

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测定原理

待测天然含氮有机物与浓硫酸共热时,被氧化成为二氧化碳和水,而氮转变成氨,氨再与硫酸结合生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解反应,在消化时常加入促进剂,硫酸铜可用作催化剂,硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点,氧化剂如过氧化氢也能加速反应。

操作方法

样品处理 测定某一固体样品中蛋白质的含量都是按100克物质的干重中所含蛋白质的克数来表示。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除去。步骤:先将样品磨细,在已称重的称量瓶中称入一定量样品,然后置105度(100度无法除去非游离水)的烘箱内干燥2小时后称重,以后每1小时再称重,直至2次称重数不变为止。

若样品属于液体物质,可取一定体积经适当稀释后,取一定量进行消化。

消化

根据样品量的多少选择适宜的凯氏烧瓶4个(此处以50毫升为例),其中2个为对照。向烧瓶内加入准确称量的样品,注意要把样品加至烧瓶底部,切勿沾在瓶口及瓶颈上。另外2个作空白对照,好对样品进行校正。

在每个烧瓶中加入约300毫克硫酸钾-硫酸铜混合物(硫酸钾:五水硫酸铜=3:1、6:1或10:1均可),再用量筒加入3毫升浓硫酸。将上述4个凯氏烧瓶放在通风良好处(最好在通风橱中进行)加热消化。先用小火加热至沸腾。此时会产生大量泡沫,应特别注意不能让黑色物质上升到烧瓶颈部,否则将严重影响分析结果。当混合物停止冒泡,蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时,将火焰调节到保持瓶内液体微微沸腾。假若发现瓶颈上有黑色颗粒,应小心地将烧瓶倾斜振摇,用消化液将其洗下。在消化过程中要时常转动烧瓶,使全部样品都浸在消化液中。当消化液呈清澈淡蓝色时即告消化结束。时间一般在5~6小时!若样品中含赖氨酸或组氨酸较多时,消化时间需要延长1~2倍。因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全。

蒸馏

采用改良式凯氏定氮仪。

1、洗涤蒸馏仪:用硼酸指示剂(取100毫升2%硼酸溶液,滴加混合指示剂约1毫升,摇匀后呈紫红色即可;混合指示剂:50毫升0.1%甲烯蓝乙醇+200毫升0.1%甲基红乙醇,存于棕色瓶中)检测是否清洗干净。干净标准:指示剂不变色。

2、样品和空白的蒸馏:取2毫升稀释消化液至加样口加入反应室,关闭加样口,另取1个装硼酸指示剂的三角瓶接于冷凝管下端。取30%氢氧化钠(W/W)溶液约10毫升,从加样口缓慢加入,当未加完时关闭,并加入约3毫升蒸馏水,再继续缓慢加入一半后关闭,让剩下的水作液封。将加热器重新放在蒸汽发生器下加热(注:在清洗仪器完毕后应拿走加热器),待三角瓶中液体由紫红变成鲜绿色起开始计时,蒸馏5分钟,然后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约1厘米,并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外周,继续蒸馏1分钟。空白同样。

3、清洗仪器:同上,不必用指示剂。

滴定

用0.0100mol/L标准盐酸(要标定,费时)滴定三角瓶中收集的氨,直至硼酸指示剂由绿变紫红。

注意:蒸馏时试验室环境中切忌有碱性雾气,否则要影响分析精度。

凯式定氮法http://baike.bbioo.com/wiki/凯氏定氮法

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