蛋白质组学

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂准备与操作步骤

相关专题
 

一、原理

细菌体中含有大量蛋白质,具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用,通过加热使蛋白质解离,大量的SDS结合蛋白质,使其带相同密度的负电荷,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上,不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色,可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量,可筛选阳性表达的重组 体。

二、试剂准备

1、30%储备胶溶液:丙烯酰胺(Acr)29.0g,亚甲双丙烯酰胺(Bis)1.0g,混匀后加ddH2O,37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室温。

2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0):Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。

3、1M Tris-HCl(pH 6.8):Tris 12.11 g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。

4、10% SDS:电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。

5、10´电泳缓冲液(pH 8.3):Tris 3.02 g,甘氨酸18.8 g,10% SDS 10ml加ddH2O溶解,定容至100ml。

6、10%过硫酸铵(AP): 1gAP加ddH2O至10ml。

7、2´SDS电泳上样缓冲液:1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml,b-巯基乙醇1.0ml,SDS 0.6 g,甘油2.0ml,0.1%溴酚兰1.0ml,ddH2O 3.5ml。

8、考马斯亮兰染色液:考马斯亮兰0.25 g,甲醇225ml,冰醋酸46ml,ddH2O 225ml。

9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

三、操作步骤

采用垂直式电泳槽 装置

(一)聚丙烯酰胺 凝胶的配制

1、分离胶(10%)的配制:

ddH2O 4.0ml

30%储备胶3.3ml

1.5M Tris-HCl2.5ml

10% SDS 0.1ml

10% AP 0.1ml

取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED 4μl ,混匀后灌入玻璃板间,以水封顶,注意使液面平。(凝胶完全聚合需30-60min)

2、积层胶(4%)的配制:

ddH2O1.4 ml

30%储备胶0.33 ml

1M Tris-HCl0.25 ml

10%SDS 0.02 ml

10%AP 0.02 ml

TEMED 2 μl

将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间,完全聚合需15-30min。

(二)样品处理:将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液,100℃加热3-5min,离心12000g×1min,取上清作SDS-PAGE分析,同时将SDS低分子 量蛋白标准品作平行处理。

(三)上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子 量蛋白标准品作对照。

(三)电泳:在电泳槽中加入1´电泳缓冲液,连接电源,负极在上,正极在下,电泳时,积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需3hr)。

(四)染色:将胶从玻璃板中取出,考马斯亮兰染色液染色,室温4-6hr。

(五)脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。

(六)凝胶摄像和保存:在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像,结果存于软盘中,凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

四、注意事项

1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

2、为达到较好的凝胶聚合效果,缓冲液的pH值要准确,10%AP在一周内使用。室温较低时,TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性,可通过皮肤和呼吸道吸收,应注意防护。

(0)

热评文章

发表评论