蛋白质组学

外源基因在原核细胞中的诱导表达

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1.目的

了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。

2.原理

外源基因克隆 在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长,lac I产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG(异丙基硫代-b-D-半乳糖),解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。

3.器材

旋涡混合器,微量移液取样器,移液器 吸头,50ml 微量离心管,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,台式冷冻离心机,制冰机,恒温摇床,分光光度计,超净工作台,恒温培养箱,摇菌试管,三角烧瓶,接种环。

4.试剂

LB培养基(加抗菌素),100mg/ml IPTG,20%葡萄糖。

5.实验准备

无菌ddH2O,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器 吸头装入相应的吸头盒(灭菌),牙签(灭菌),摇菌管(灭菌),100mg/ml IPTG (过滤灭菌)(100ml分装,-20°C保存),100mg/ml氨苄青霉素(过滤灭菌)(100ml分装,-20°C保存),配制20%葡萄糖(8磅灭菌20分钟,添加至上述LB中,终浓度为0.2%)。

6.操作步骤

(1) 晚上9:00接种。在超净工作台中接种含有Pinpoint™xa-3-CHI重组 载体的菌株,培养于两个三角烧瓶各20ml LB-葡萄糖培养基(含抗菌素Amp 120μg/ml)的摇菌管中,慢速70~90转/分钟30°C摇菌过夜。

(2) 至第二天上午8:30 OD600约为0.5,加IPTG至 100μg/ml,150~170转/分钟37°C诱导1.5-3h。同时做不加IPTG诱导和非转化的空菌诱导的对照培养。

(3) 4000rpm离心15min弃掉上清液,收获菌体,用SDS-PAGE电泳分析(表达蛋白分子 量为30kDa)。菌体也可放在-20°C以下保存备用。

(4) 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面。

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