蛋白质组学

MTT比色法检测影响细胞活力相关蛋白的操作步骤

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一、mtt 比色法检测细胞活性

(一)原理

活细胞内线粒体 琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷,其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。

(二)试剂准备

1、青链霉素溶液(100X):青霉素100万U,链霉素100万U,溶于100mlddH2O中,抽滤除菌。

2、L15基础培养基:1000mlL15培养基,加2g碳酸氢钠,10ml 100X青链霉素,5mlHEPES。

3、MTT液:5mg/ml溶于L15基础培养基。

4、SDS处理液:20gSDS,50μl二甲基甲酰胺,加双蒸水50ml溶解。

5、L-多聚赖氨酸:50μg溶于1ml双蒸水中。

6、L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。

(三)操作步骤(以背根神经节细胞培养 为例)

1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节(DRG)。

2、镜下去除神经根和外膜,放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min,每5min摇匀一次。

3、洗去胶原酶,吹打分散后,接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中,每孔含100μl无血清L15培养基,细胞约800个。

4、实验组分别加入纯化的表达蛋白(分别以不同的蛋白浓度),阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。

5、37℃ 5%CO2培养48hr后,每孔加入10μl MTT,37℃ 5%CO2孵育4hr。

6、加入100μl 20%的SDS处理液,37℃孵育20hr。

7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值,数据分析。

二、DRG无血清培养检测促神经生长作用

操作步骤:

1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠DRG。

2、镜下去除神经根和外膜,接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中,每孔1个DRG。

3、待DRG贴壁后加入100μl无血清L15基础培养基,实验组加入纯化的表达蛋白(分别以不同的蛋白浓度),阴性对照加入等体积的溶解表达蛋白的溶剂。

4、37℃ 5%CO2培养,每天在Olympus倒置显微镜下观察细胞的生长情况,并进行测量,其数据作统计分析。

三、注意事项

1、MTT有毒,注意防护。

2、单个DRG贴壁实验操作难度较大,需仔细耐心。

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