蛋白质组学

蛋白质定量大全

相关专题
LOWRY法蛋白定量专题

蛋白质定量貌似简单的实验,其实还是有一些学问的,蛋白质测定的方法有很多种,到目前为止还没有哪种方法符合大众所有的要求的,本文总结了Bradford斑点试验、Coomassie 斑点试验、紫外分光度检测法以及BCA法.

一、Bradford法

该方法用于大多数蛋白质定量是相当精确的,特别是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶 或溶菌酶等。但是,去污剂的浓度超过0.2%则影响定量结果。如TritonX-100,SDS,NP-40等。

1. Bradford染液配制:将100mg考马斯亮蓝溶于50 ml 95%的乙醇中,加入100ml 浓磷酸,然后,用双蒸水补充至200ml,放4C至少6个月。

2. 作标准曲线的蛋白质样本的准备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准蛋白,例如进行抗体定量,可用纯化的抗体作为标准蛋白。如果待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg-150μg/100μl之间绘制标准曲线。

3. 将待测样本溶于100μl缓冲溶液中,该缓冲溶液应于作标准曲线的缓冲溶液相同;

4. 按1:5用双蒸水稀释浓染料结合溶液,过滤离心沉淀物;

5. 每个样本加5ml稀释的染料结合溶液,作用5-30min。染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,即可在595nm光波长下测定其吸光度。注意,颜色反应不得超过30min;

6. 应用标准曲线计算待测样本的浓度。

注意:应用Bradford法测定BSA 的值是其重量的两倍。

二、Bradford斑点试验

该方法特别适用于检测洗脱组分,以定位蛋白洗脱液。例如检测洗脱液的吸附力的强弱。

1. 首先,浓缩Bradford染液。将100mg考马亮蓝溶于50 ml 95%的乙醇中,加入100ml 浓磷酸,然后,用双蒸水补充至200ml,放4C至少6个月。这种染液也可从Bio-Rad公司购到;

2. 将8μl待测蛋白质样本转移至一 条Parafilm,Saran Wrap上或微孔板孔中。同时应设一洗脱液样本作为空白对照;

3. 每个样本孔中加2μl浓Bradford染液并混匀;

4. 大约2min后,含有蛋白质的样本将变蓝。该方法的灵敏度约为10μg/ml。此反应对去污剂的浓度超过0.2%时非常敏感。但KCl,NaCl,MgCl2 或EDTA 对其无影响,Tris对其仅有轻微的影响。

三、Coomassie 斑点试验

该方法特别适用于检测洗脱组分以定位蛋白洗脱液。例如检测洗脱液的吸附力的强弱。

1. 裁剪3MM厚的Whatman 纸约4mm2 ;

2. 每个样本点5μl于Whatman 纸上;

3. 自然干燥样本或用电吹风吹干斑点,约1min或更少;

4. 将纸块浸入0.25%的考马斯亮蓝溶液中(考马斯亮蓝溶于10%的甲醇,7%醋酸中) 30min;

5. 将纸块放入10%的甲醇,7%醋酸溶液中洗涤3-5 min,然后干燥。

四、紫外分光度检测法

蛋白质紫外光吸光率是所有的蛋白质定量方法中最快的方法。通常在280nm光波长下读数。其在280nm光波长下的最大吸光率主要处决于酪氨酸和色氨酸的存在。在205nm光波长的吸收也常用到。其在205nm光波长下的最大吸光率主要处决于肽链,尽管氨基酸也有影响。另外,一个主要的优点是在测定蛋白质浓度时,样本不会遭到损害。

1、纯蛋白质溶液:

① 在280nm光波长下读取与适当的对照相比较的吸光率;

② 对于抗体和BSA ,可应用下表计算其浓度对其他蛋白质可粗约地估计:1个单位吸光率相当于1mg/ml。

蛋白质 A280 (1mg/ml)

IgG 1.35

IgM 1.2

BSA 0.7

2、含有核苷酸的蛋白质溶液

① 在280nm和260nm或280nm和205nm光波长下读取与适当的对照相比较的吸光率;

② 用下列等式粗略计算其浓度:

蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55×A280 )-(0.76×A260 )

蛋白质浓度(mg/ml)= A205 /(27 + 120 A280/ A205 )

五、BCA法:

由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28mg/ml

BCA法特点: 1. 灵敏度高,检测浓度下限达到25μg/ml,最小检测蛋白量达到0.5μg,待测样品体积为1-20μl 。 2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响,可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween 20,60,80。 3. 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。 4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响:EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM

BCA法和Commassie法各有优势,在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用,以消除定量的误差。

Bradford法、Coomassie 法、紫外分光度检测法以及BCA法各有优缺点,要根据实验的目的去选择合适的蛋白定量方法,主要依据是缓冲液的化学组成和待测的蛋白的浓度。

(0)

热评文章

发表评论