蛋白质组学

蛋白质分析的相关技术介绍

一、蛋白质分离的一般程序

蛋白质的种类、性质、所处体系以及蛋白质分离纯化的目的不同,因此,不可能有一个固定的程序适用于各类蛋白质的分离工作。但这并不意味着蛋白质的分离纯化没有一定的规律,实际上多数分离纯化工作中都有相类似的步骤与手段。蛋白质分离纯化的一般程序:

生物体组织细胞→破碎→离心→盐析、等电点沉淀→凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析和高效液相层析。

二、材料的选择及注意事项

分离纯化蛋白质首先应考虑选择适当的材料。人体的手术标本、培养的细胞、动物组织以及微生物是蛋白质的主要材料来源。选择材料要依据试验目的及遵循以下原则: 1、所含目的蛋白含量高;2、材料易得。

蛋白质含量受性别、年龄、季节、饲养条件及培养条件的影响,另外不同的生物体及同一生物体的不同组织细胞的蛋白质含量和分布有很大差异,在正常状况及病理状态下,其蛋白质的组成及含量也有很大的不同,这些是我们在分离纯化蛋白质时应注意的。材料选定后,通常进行预处理,将不必要的结缔组织、脂肪组织等在尽可能接近生命状态下剔除,处理后应立即使用或在冷库中保存。制备某些易在体内被分解的活性蛋白质、酶或蛋白激素时,一般宜用新鲜材料。

三、细胞和组织的破碎方法

除了提取体液、细胞外某些多肽激素、蛋白质、酶不需要破碎细胞外,对于细胞内及多细胞生物组织中各种蛋白质的分离纯化,都需事先将细胞和组织破碎,使蛋白质充分释放出来。不同的生物体或同一生物体的不同组织,细胞破碎难易不一,使用的方法也不尽相同,如胰脏、肝脏、脑组织一般比较柔软,用普通的匀浆器研磨即可;肌肉、心脏组织较韧,需预先绞碎再作匀浆;许多微生物都有坚韧的细胞壁,需用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波和加压处理等方法。目前已建立了很多破碎细胞,释放细胞内容物的方法。根据作用方式不同一般将其分为机械法、物理法电化学法三大类。

(一)机械法

通过机械切力作用使组织细胞破碎的方法称为机械法,如匀浆、研磨等。

1、匀浆是破碎机体软组织最常用的方法之一。其原理是将组织剪切成小块,再加入3-5倍体积的预冷匀浆缓冲液,通过固体剪切力破坏组织和细胞,释放蛋白质进入溶液。它是通过匀浆器来进行的。市售匀浆器有四大类:刀片式组织破碎匀浆器、内切式组织匀浆器、玻璃匀浆器及用于规模生产的高压匀浆器。实验室常用的是由电力驱动,通过调节速度完成匀浆制备的切片式匀浆器。

2、组织捣碎机方法由调速器、支架、马达、带杆刀叶、有机玻璃筒等部分组成。操作时,将材料配成稀糊溶液,放置于玻璃筒内约占1/3体积,固定筒上盖子,将调速器拨至最慢处,开动马达后,逐步加速到所需速度。一般市售捣碎机转速最高可达10000-20000转/分。捣碎过程注意维持低温,筒外可放置冰水浴。

3、研磨是破碎单一细胞的有效方法。借助于研磨中磨料和细胞间的剪切及碰撞作用破碎细胞。常用的磨料为沙子、氧化铝等。主要用于细菌、酵母等的破碎。

(二)物理法

通过各种物理因素作用使组织细胞破碎的方法称为物理法。

1、超声法 输入高能超声波可以破碎细胞,其机理与超声波作用溶液时的气泡产生、长大和破碎的空化现象有关。空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞裂解。超声波破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等。超声波破碎在处理少量样品时操作简便,效率高,液量损失少,适于实验室使用。但应注意的是超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活,另外噪声也比较大。

2、反复冻融法 把待破碎样品冷至零下15℃-20℃,使之冻固,然后缓慢地溶解,如此反复操作,大部分动物性细胞及细胞内颗粒可被破碎。由于在此过程中易使活性蛋白失活,故适用于提取非常稳定的蛋白质。

3、冷热交替法 将材料投入沸水中,在90℃维持数分钟,立即置于冰浴中,使之迅速冷却,绝大多数细胞被破坏,一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质。4、低渗裂解法 是指无胞壁细胞在低渗溶液中,通过渗透张力作用裂解的方法,常用于红细胞的裂解。

(三)化学法

1、有机溶剂法 有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性,使内含物有选择性的渗透出来。丙酮也是常应用的有机试剂,它不仅可以有效地破碎细胞膜,而且可以制成具有蛋白活性的干粉,即丙酮粉,它能长时间保存,另外它还可以脱去脂肪,便于后续的抽提。

2、表面活性剂 较常用的有十二烷基磺酸纳(SDS)、Triton X-100、NP-40和脱氧胆酸等。

3、酶解法 用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法称为酶解法。利用此法处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶。常用的有溶菌酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶等。细菌主要用溶菌酶处理,酵母需用几种酶复合处理。酶解时应注意控制温度、酸碱度、酶用量、先后次序及时间。

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