蛋白质组学

SDS-PAGE后考染和脱色的方法及注意问题

花了点时间整理了园内有关考染的帖子,拿出来共享,希望对刚动手做WB的战友有所帮助。

12.5%考马斯亮蓝染色液的配制(含30%甲醇,10%乙酸)
考马斯亮蓝R250 0.125g
甲醇 30ml
冰乙酸 10ml
加ddH2O至 100ml
染胶1h~2h
脱色液配制(含30%甲醇,10%乙酸)
甲醇 30ml
冰乙酸 10ml
加dd H2O至 100ml
注:1. 染色液可回收利用;室温保存即可;甲醇可以用乙醇代替。
2.其它脱色液:
(1)用水脱色,但效果非常不好,建议不要用。
(2)脱色液也可以用0.5%mol/l的氯化钠,没有气味,脱色效果也不错。但胶可能会胀的厉害!
(3) 20%的甲醇和0.1M的tis-磷酸(PH6.5)
先用tis-磷酸(PH6。5)漂洗2min,然后用20%的甲醇漂洗1min(最好不要超过1min),最后用20%的NH4SO4固定30min
3. dd H2O煮法脱色
PAGE胶染色完毕后,如果用一般的甲醇-乙酸脱色液进行脱色,一般至少需要2-3h,可利用蒸馏水煮的方法:
(1). 先将500ml蒸馏水放在一个干净的烧杯中,在电炉上煮沸。
(2). 将染色好的胶用DD水冲净后放入煮沸的蒸馏水中,煮3~5min。
(3). 将DD水倒掉,看胶是否已经脱净,如果还不好,可以用少量水再煮一次。
一般整个脱色过程最多15min即可搞定!还可以避免每次脱色时的醋酸味!
4. 重复利用
(1) 染色液和脱色液重复次数不一定的,可以根据他们的着染能力和脱色能力考虑是否换新的.夏季甲醇挥发快,用3~5次应该可以用.当然,用时要加盖.
(2)脱色时注意防止挥发,脱色液可以用活性碳处理后反复用多次的.
(3)脱色液反复使用,用两三次后用活性炭“包被”的滤纸过滤,滤纸可反复使用。脱色液反复使用后,胶有点泛红,但不影响观察,如果要发表,建议用新配脱色液。
5. 加快染色和脱色速度
(1)染色和脱色都可以在微波炉中加热甚至煮沸,很省时间。但注意不要沸腾时间太长,否则容易把胶上煮出泡状的破损。
(2)若为了提高考染及脱色速度,可在45℃左右的水浴中进行,染色时间只需几分钟(其间轻轻晃动一二次,整个胶变为较深的亮兰色即可)。脱色也在水浴中(约需15分钟),
(3)胶放入用乙醇-乙酸配成的脱色液后微波加热10秒钟至微热,上摇床,10分钟后,倒掉,换新的脱色液重复一次,不超过半个小时也好了.
(4)用乙醇和乙酸配脱色液,然后加热脱色,很快的,可加热到马上要沸腾为止。不但脱色可以,染色也可加热,速度也很快
(5)用蒸馏水洗胶,并放在微波炉里加热,效果很好。
只是要掌握好时间,时间太长而蛋白的含量又比较低的话,容易脱过了!
(6)加入甲醇-乙酸脱色液后,将其直接放到微波炉里加热一分钟,然后放几张干净的tissue进去(把它叠成条状,沾在脱色皿边上就OK啦!(不要和胶混在一起)),能吸去很多染料,加快脱色,效果不错。
6. 注意问题
(1)胶脱色不能脱的太久,虽然越脱越清楚,但脱的太久了,弱带就看不见了,胶也会变的失真,这样的胶照出的照片是很难被接受的。如果样品条带或点不是很浓,就不可以脱太久。但如果要拍照,最起码要保证底色脱完全,要不然照片效果也不会好的。
(2)如果需要长时间脱色,注意要换脱色液,且量要足够,否则甲醇挥发很快,胶容易干卷.把本底脱干净后可以把胶放水中保存.半个月应该没问题;《分子克隆》:长期保存可以在水中加20%的甘油。也有站友经验:考染不能长时间保存,尤其是在水里,3天颜色就会溶到水里。具体情况要自己摸索了。
7. 胶一般应放20%的甘油中长久保存(见“分子克隆”)

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