蛋白质组学

免疫电泳技术

一、基本概况

(一)原理:蛋白质是一种两性电解质,它同时具有游离氨基和羧基。每种蛋白质都有它自己的等电点。等电点的高低取决于蛋白质的性质,在等电点时,蛋白质所带的正负电荷相等。在pH大于等电点溶液中,羧基解离多,此时蛋白质带负电荷,带负电荷的蛋白质在电场中向正极移动。反之,在pH小于等电点的溶液中,氨基解离多,此时蛋白质带正电荷,在电场中向负极移动。这种带电质点在电场中向着带异相电荷的电场移动,称为电泳。带电质点所以能在电场中移动以及具有一定的移动速度,取决于其本身所带的电荷、电场强度、溶液的pH值、粘度以及电渗等因素。

(二)影响电泳的因素

不同带电质点在同一电场中的迁移率(或泳动度)不同,影响迁移率的因素有:

①带电质点的性质:即颗粒所带净电荷的量,颗粒大小及形状等。带电荷越多,分子越小,泳动速度越快;

②电场强度:电场强度是单位厘米的电位差。电场强度越大,带电质点泳动速度越快。反之亦然;

③溶液中pH值:溶液的pH值决定了带电质点的解离程度,也决定了物质所带电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言,pH值离等电点越远,颗粒所带的电荷越多,电泳速度也越快。反之则越慢。蛋白质在酸性溶液中易变性,在偏碱溶液中比较稳定,所以蛋白质电泳大多用pH8.2~8.8的巴比妥或硼酸缓冲液,在这种pH中,血清蛋白一般都带负电荷;

④溶液的离子强度:溶液的离子强度越高,颗粒泳动速度越慢,反之越快。血清电泳一般最适宜离子强度在0.025~0.075之间。离子强度越低,缓冲液的电流下降,扩散现象严重,使分辨力明显降低。离子强度太高,将有大量的电流通过琼脂板,由此而产生的热量使板中水分大量蒸发,严重时可使琼脂板断裂而导致电泳中断。溶液中离子强度与溶液的浓度成正比。μ=1/2∑CZ2(μ为离子强度,C为克分子浓度,Z为离子的价数);

⑤电渗作用:电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。由于琼脂中含有SO42-,带负电荷,造成静电感应致使附近的水带正电荷,而向负极移动,所以电泳时有两种力,即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电荷,向负极移动,则因电渗作用向负极移动得更快。如果物质向正极移动,所带电荷少,电泳力抵不过电渗力,则也向负极移动,血清中的γ球蛋白就是如此;

⑥吸附作用:即介质对样品的滞留作用。它导致了样品的拖尾现象而降低了分辨率。纸的吸附作用最大,醋酸纤维膜的吸附作用较小或无;

⑦电泳时间:电泳时间与迁移率成正比。

(三)电泳中常用仪器

1.电泳仪

2.电泳槽 一般采用闭合式,即为了防止在电泳过程中产热,而使琼脂凝胶水分过度蒸发的设施。作电极用的铂金丝必须与电泳槽等长,这样电场才能均匀。电泳槽容量不宜过小,以防止溶液的浓度、pH值或离子强度发生改变,影响电泳条件的恒定性。

(四)琼脂的选择和制备

电泳是利用一种支撑物作为一种介质让带电粒子通过,而其本身不发生变化。支撑物一般是采用琼脂或琼脂糖、纤维素膜、滤纸以及聚丙烯酰胺凝胶等。

1.支撑物的条件

⑴惰性物质,电泳后本身不发生变化。

⑵制成凝胶后,其分子排列均匀,孔径大小一致便于带电质体自由通过。

⑶透明、无杂质、电渗作用小,并且有一定的粘度与脆性。

⑷价格便宜。

一般多用琼脂粉或琼脂糖。琼脂糖是琼脂粉进一步提炼而成,很少或几乎无电渗作用。

2.凝胶板的制备 称取所需要量的琼脂粉,加入缓冲液(琼脂浓度一般1%~2%,琼脂糖0.75%~1.5%),同时加万分之一的硫柳汞防腐。水浴煮沸,待琼脂完全溶化后,液体清凉,再煮一段时间。选择适当大小的、无油腻、无划痕的干净玻璃板,根据所需的厚度(一般为2mm~4mm厚),计算好琼脂的用量。把玻片置于事先用水准仪测试的平台上,倒入熔化的琼脂,注意不要产生气泡。冷却后,按事先制好的图形大孔,用点水笔尖挑去孔内的琼脂,在火焰下轻烤以封底,以防止样品从琼脂底部泳过。然后加样,不用的琼脂板,放入冰箱中,注意防止干涸和冰冻。

(五)缓冲液的选择与配制:常用的电泳缓冲液有以下两种。

1. pH8.6离子强度0.025Mol/L~0.075Mol/L的巴比妥缓冲液,配制方法如表2-1: 离子强度

离子强度

巴比妥钠(g)

巴比妥(g)

加水至(ml)

0.075

15.45

2.76

1000

0.050

10.30

1.84

1000

0.025

10.30

1.84

2000

表2-1 巴比妥缓冲液配制

2.pH8.6硼酸缓冲液,离子强度0.05Mol/L

硼酸 6.70g

硼砂(Na2B4O7·10H2O)13.40g

H2O 加至 1 000ml

缓冲液配制后,加万分之一的硫柳汞防腐。两侧电泳槽加缓冲液至2/3~4/5的槽体积,注意两侧一样多,以免造成液面差,产生虹吸作用,影响电泳。当蛋白质泳动至槽内后,就应该更换缓冲液。有人认为长久电泳过的电泳液易于把血清中各成分分开,而新配制的则差一些。为了防止缓冲液离子强度的改变,可以在每次电泳时更换正负极(这是目前广泛采用的);也可以在下一次电泳前,将两槽内的缓冲液混合后再用。但也有人认为不能混合再用,必须更新。

(六)电场强度的显示

以V/cm长或I/cm宽表示。电压的测量必须用电压表测量凝胶板两端的电压差,再除以板长,而不能以电泳仪上的电压数表示,当然这两者有一定的相关性。电泳仪上的电流强度除以凝胶板宽即可代表电场强度。在实际工作中,很难有两项指标都符合的调控,因此只能根据取其一个指标进行调控,一般多按电流计算。

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