蛋白质组学

转移电泳实验技术

原理:转移电泳是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出的蛋白质谱直接转移到硝酸纤维膜上,而形成固定相,并同时排除各种干扰物质,保持其天然构象和生物学活性,完成在凝胶中难以进行的各种生物试验。

材料

1.琼脂糖

2.丙烯酰胺

3.甲叉双丙烯酰胺

4.十二烷基磺酸钠(SDS)

5.硝酸纤维膜滤纸 孔径0.45μm

6.琼脂糖凝胶电泳缓冲液 0.89mMol/L Tris—89mmol/L 硼酸—2.5mMol/L EDTA(pH8.3)。

7.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液 0.05Mol/L Tris—0.384Mol/L 甘氨酸—0.1%SDS(pH8.3)。

8.蛋白质转移电泳缓冲液 25mMol/L Tris—192mMol/L 甘氨酸—20%甲醇(pH8.3)。

9.溴乙啶溶液 称取5mg溴乙啶,用无离子水溶解。定容到10ml,取1ml稀释到1 000ml,最终浓度为0.5μg/ml。10.考马斯亮兰R-250染色液 0.25%考马斯亮兰R-250-10%醋酸-45%甲醇。

11.氨基黑染色液 在含10%醋酸的甲醇中加入氨基黑10B至饱和。

12.垂直板型及水平板型凝胶电泳槽

13.转移电泳槽

14.直流稳压电源0V~800V,0mA~100mA

操作方法

1.SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳(垂直板型)分离蛋白质。

⑴凝胶的制备:丙烯酰胺 15.00g ;甲叉双丙烯酰胺 0.40g ;0.37Mol/L Tris—HCl(pH8.3)50ml ,此为丙烯酰胺母液,过滤后4℃保存备用。丙烯酰胺母液 8.30ml ;N、N、N、N—四甲基乙二胺(DEMED)250μl ;10%SDS 0.25ml ;0.375Mol/L pH8.8 Tris-HCl16.45ml 混合即为10%分离胶。

丙烯酰胺母液 1.30ml;TEMED 15.00μl ;10%SDS 0.10ml ;0.125Mol/L pH6.8Tris-HCl8.60ml 制成4%浓缩胶。

将分离胶与浓缩胶真空抽气10min~15min,备用。

⑵凝胶板的制备及加样:取1%的琼脂将凝胶膜底部的缝隙封固。在10%的分离胶中加入10%过硫酸铵0.25ml,混匀后,立即沿玻璃壁缓缓加入胶膜中,上端留出5cm的高度,然后用带有细针头的注射器轻轻地向胶面加入蒸馏水,静置数分钟,水胶界面消失,约20min~30min界面清晰(凝胶已聚合),用注射器将水吸出,并用滤纸吸干余水。

在4%浓缩胶中加入10%过硫酸铵0.4ml,混匀后,沿玻璃壁缓慢倒入已聚合的分离胶的上面,立即插进样品槽模板。待凝胶聚合后(约20min~30min),轻轻拔出样品槽模板。将电泳缓冲液加入上、下电泳槽。

将分离的蛋白质样品用0.01Mol/L Tris-HCl(pH8.0)-0.001Mol/L EDTA-1%SDS-5%硫基乙醇溶液作1︰1稀释,100℃加热处理3min之后,加入甘油10%及适当量溴酚兰,用微量注射器将样品注入样品槽中,蛋白质最后浓度一般为0.05mg/ml~1mg/ml。

⑶电泳:上端接阴极,下端接阳极。电压120V、电流30mA,电泳时间5h~6h,待染料泳至距底部约1cm处时断电。

⑷染色:切下一部分凝胶,用考马斯亮兰R-250染色作为对照。其余部分作转移电泳。

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