蛋白质组学

测定蛋白浓度三种常见方法

酪安酸差色光谱法
1.  打开分光光度剂,预热30分钟,是紫外灯处于稳定发光状态
2.  在2容积为1mlde 微量石英比色杯中分别加入900ulPH7.4,PH12.0的0.1mol/l磷酸缓冲液,把盛有PH12.0缓冲液的比色杯放入样品杯中放入支架上,把盛有PH7.4缓冲液的比色杯放入到参比杯的支架上,然后准确的测出295nm波长下的光吸收值,或用250-350nm扫描
3.  在上述的2个比色杯中分别加入100UL的待测样品液,小心振荡混匀
4.  重复2操作
5.  计算蛋白浓度:﹝(PH为12.0A295-PH为7.4A295)/2.330×N﹞×W
N是蛋白分子中酪安酸毫摩尔消光系数之差
W是样品稀释倍数
紫外光吸收法测定蛋白浓度
1.  用品和仪器:紫外分光光度剂,微量自动取液仪
2.  试剂:标准蛋白质溶液:准确称重的纯净蛋白质,配成1mg/ml储液置于4度中备用
0.1mol/l磷酸缓冲液,PH7.4;0.1mol/l磷酸缓冲液,PH12.0
3.试验程序:
1,在2个洁净干净的石英比色杯中(内径1cm)中加入蒸馏水或其他用于溶解标准蛋白质与待测样品的缓冲液,其中一个作为参比杯(在以后测量不变),另一个作为样品杯,放入分光光度剂的相应位置
2,记录下空白杯在280260nm处的光吸收值,或对之进行250-350nm波长范围的基线扫描
3,移去样品比色杯中的蒸馏水或是缓冲液,干燥比色杯(用滤纸吸取残液)
4,在样品比色杯中加入待测样品液,在实验中提取样品30ul加入2970ul双证水,混匀,样品液事先通过离心或用0.2um孔径的滤膜过滤
5,重复2步骤
6.蛋白含量计算:蛋白浓度(mg/ml)=1。55A280—0.76A260

Folin法测定蛋白含量
1.  用品和仪器:分光光度剂,试管及试管架,微量自动取液仪(20,100,200,1000UL)
2.  试剂:试剂甲:贮液A(4g/100mlNa2CO3),贮液B(0.2mol/100lNaOH),贮液C(1g/100mlCuSO4.5H2O),贮液D(2g/100ml 酒石酸钾钠)临用前将A和B等体积混合为碳酸钠-氢氧化钠溶液,C与D混合盛Folin-酚试剂甲,一天内有效
试剂乙:取乌酸钠100G,目酸钠25G,置于2000ml膜口回流装置内,加蒸馏水700ml,85%磷酸50ml和浓盐酸100ml,充分混匀,使其溶解。小火加热,回流10小时(烧瓶中加入玻璃珠以防溶液外溅)再加入硫酸锂150g蒸馏水50ml及液溴数滴,在通风厨开口煮沸15分钟,以除去多余的溴,冷却后定容与1000ml,过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液,颜色为鲜黄色,置于棕色瓶中,可在冰箱长期保存,颜色变绿,在加几滴溴,煮沸数分钟,恢复原色
试剂乙在使用前应该确定其酸度,使之滴定标准氢氧化钠试剂(1mol/l),以酚酞为指示剂,当溶液颜色由红-紫红-紫灰-墨绿即可为终点,酸度为2MOL/L将其稀释到1mo/l即可
标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清蛋白3mg溶于双证水中,定容于10ML,浓度为0.3mg/ml
3实验方法:1。取16mm*150mm试管13支,标明号码,放置与试管架,在1-11号试管中分别加入标准牛蛋白血清(0.3mg/ml)0,0.1,0.2--------1.0ml,补足双蒸水至每管体积1.0ml,在12,13管中加入待测样品100UL,并补足双蒸水至1。0ml
3.  加入5.0ml新配置的试剂甲,立即混匀,在室温下放置10分钟
4.  各管中加入0.5ml试剂乙,充分混匀,(用振荡器),然后室温放置30-60min
5.  将标准样及待测样品在可见光光度计上比色,如果蛋白含量低于500UG/ML,在750nm下比色,如果在100ug/ml之内,则在550nm波长下比色
6.  根据已知含量的标准样品测得的光吸收值做标准曲线,然后根据待测样品的光吸收值在标准曲线上查出蛋白含量

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