蛋白质组学

【原创/分享】GS115毕赤酵母表达外源蛋白较详细步骤!!!(从验证到阳性克隆的筛选)

小弟把最近一个多月来所做的工作,做了个总结,供大家一起分享,希望版主能加分,现在我还是0分,很多帖子不能阅览,希望版主加分,今后我实验有了新的进展,我会把总结发上来,和大家一起分享。我做的是GS115表达VEGF,目前已经做到阳性克隆的筛选这一步。待以后再次做了总结,再与大家分享。希望大家支持,绝对原创!!!

一.实验材料
1.菌珠
E.coli DH5α
GS115酵母菌
2.质粒
PIC9K/VEGF165重组质粒
3.试剂
NB酵母氮源
G418
gl2、Not1、Sal1
山梨醇
质粒抽提液:溶液1,溶液2,溶液3
酚:氯仿(1:1)
rTaq、dNTP(2.5mM)、10×Buffer
上游引物VP5(25nmol/L):5’-TAGAATTCGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3’
下游引物VP3(25nmol/L):5’-TAGCGGCCGCTTACCGCCTCGGCTTGTC-3’
4.仪器
电穿孔仪:Bio-Rad公司产品
Power/Pac 1000型电泳仪:Bio-Rad公司产品
Mini-垂直电泳槽:Bio-Rad公司产品
PCR仪
5.  各种培养基
(1)  LB培养基
Peptone 10g
酵母抽提物 5g
氯化钠 10g
溶于蒸馏水,定容到1000ml,高压灭菌,121度20min。如做平板,则加15g 琼脂粉,待冷却至50度左右加入AMP至终浓度为50ug/ml。
(2)  YPD培养基
Peptone 2g
酵母抽提物 1g
溶于蒸馏水,定容至96ml,高压灭菌121度20min,待冷却至室温后,加入4ml50%葡萄糖。做平板则加15g琼脂粉。
(3)  MD平板
称15g琼脂粉与860ml蒸馏水中,高压灭菌121度20min,冷却至60度左右,依 次加入:
10×YNB 100ml
500×生物素 2ml
50%葡萄糖 40ml
混匀后迅速到如灭菌平板上。
(YNB,生物素,葡萄糖用0.22μM孔径的细菌滤器过滤除菌)
(4)  MM平板
配法如MD平板,只是将甲醇替代葡萄糖,至终浓度为0.5%。
(5)  YPD-G418平板
先配好YPD溶液,冷却至60度后加入不同量的100mg/ml的G418溶液。配称不同浓度的YPD-G418平板。(G418过滤除菌)
(6)  BMGY/BMMY培养液
Peptone 20g
酵母抽提物 10g
溶于780ml蒸馏水中,高压灭菌121度20min,待冷至室温后,加入:
1M磷酸钾缓冲液(PH6.0) 100ml
10×YNB 100ml
500×生物素 2ml
50%甘油 20ml
如是BMMY培养液,则用甲醇代替甘油。
1M磷酸缓冲液:1M磷酸氢二钾 132ml
1M 磷酸二氢钾 868ml
溶于蒸馏水,用KOH调PH到6.0,定容至1000ml,高压灭菌121度20min。
二.实验内容
内容一:重组质粒的验证(由于长期保存,担心目的基因丢失)
1,电转DH5α
在60ul感受态细胞中加入连接液1ul,混匀,加入预冷的0.1cm的电转化杯中,调好电击参数(电压1200v,电阻200Ω,电容25uF),点击完毕,用1ml不含抗生物的LB培养液洗出,37度水浴放置50min,取100ul涂布氨卞平板(100mg/L),置于37度培养箱,过夜。
2,小提质粒
挑取阳性克隆于4ml氨卞培养液中,过夜培养。取1.5ml菌液12000rpm离心15s收集菌体

按照每毫升菌体加:溶液Ⅰ100ul(冰浴5min剧烈振荡)
溶液Ⅱ200ul(冰浴5min轻轻混匀)
溶液Ⅲ150ul(冰浴5min轻轻混匀)

12000rpm×5min

上清加入RNAse(10mg/ml)37度1hour后加入等体积酚:氯仿(1:1),剧烈振荡

12000rpm×5min

取上清,加入等体积氯仿,12000rpm,5min

上清加1/10体积3MNaCl和2体积无水乙醇

-20度沉淀10min后,用70%乙醇洗涤,晾干后加入适量适量双蒸水溶解
3.Pcr验证
DdH2O 14.2ul
10×buffer 2ul
dNTP(2.5mM) 2ul
上游引物VP5(25nmol/L) 0.5ul
下游引物VP3(25nmol/L) 0.5ul
质粒 0.5ul
rTaq 0.3ul

20ul体系

94度1min
94度5min 68度 45s ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min
结果见图:

490bp

酶切验证:ddH2O 6ul
10×buffer 2ul
BSA 2ul
BglⅡ 1ul
NotⅠ 1ul
质粒 8ul
20ul体系
结果见图:

Pcr验证和酶切验证结果表明提取的质粒为重组质粒pPIC9K/VEGEF,可以大规模抽提质粒,供电转化酵母。
内容二:VEGF表达菌珠的筛选
1,大规模抽提验证成功的重组质粒(100ml菌液,方法同上)
2,重组质粒的线性化:
pPIC9K重组质粒 44ul
SalⅠ 1ul
10×buffer 5ul
50ul体系

37度酶切2h,65度灭活20min,1%琼脂糖电泳,检测。第一次用DNA回收试剂盒回收凝胶,但是回收率太低,因此线性化后直接考虑用1/10的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀。加少量水溶解,取1ul检测。
3,制备酵母感受态:(1)挑菌于5mlYPD培养液中30度培养过夜。
(2)取0.1-0.5ml菌液于500ml新鲜YPD培养液中培养过夜,OD600=1.3-1.5。
(3)离心,1500g,5min,4度。用500ml冰冷无菌水重悬菌体。
(4)离心,然后用250ml冰冷无菌水重悬。
(5)离心,然后用20ml冰冷山梨醇(1M)重悬。
(6)离心,用1ml冰冷山梨醇重悬。每管100ul分装于1mlep管中,-80度保存。
4,电打孔法转化酵母
把BIO-RADE电打孔仪调好个参数(电压1500v,电阻:200Ω,电容25uF),将线性化重组质粒15ul加入制备好的100ul酵母感受态细胞中,混匀,冰上预冷5min,转入0.2cm电打孔杯(预先放冰上预冷)中,置于冰上10min,放入电打孔仪,电击后取出,迅速放回冰上并加入1ml预冷1M山梨醇中,混匀,置于30度摇床震摇40min,吸取300ul涂布于MD平板上,30度培养2天。
5,阳性平板高拷贝克隆筛选
将MD平板上长出的His+克隆,用3mlYPD培养液冲洗后,用涂棒涂匀,吸取菌苔液于1.5mlep管中,测定OD值为3.7。1OD=5×107cells/ml,3.7OD=1.85×108cells/ml,一般涂布浓度为105/200ul,因此稀释100倍。取200ul涂布于不同浓度梯度的YPD-G418平板上(浓度依次为:0.25,0.5,2.0,4.0,8.0mg/ml)。30度培养两天。
6,mut+基因型的筛选
将在4.0,8.0mg/ml长出的高拷贝克隆,先点在MM平板上,再点在MD平板上,培养,观察两个平板上的生长情况。可是发现在MM平板上长的比MD平板上慢,以为时muts型了,但觉得这种方法来筛选mut+不可靠,因此又决定用pcr验证来筛选。
步骤一:酵母基因组DNA的提取
取1ml菌液,离心弃上清,用100ul水清洗沉淀,加入100ulTE重悬,再加入10ul 5U/ul的zymolyase,30度作用30min,加入1ml酵母裂解液(100mmol/L,10mmol/LTris.HCl,25mmol/LEDTA,0.5%W/VSDS,蛋白酶k终浓度0.1mg/ml)65度水浴使其充分消化,加入等体积酚:氯仿(1:1),高速震荡3min,离心,收集上清,加入1/10的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀,离心,70%乙醇洗涤,晾干后,收集沉淀,20ulddH2O溶解。
步骤2:用VEGF基因引物和AOX1基因引物分别进行pcr验证。
PCR1: H2O 12ul
10×buffer 2ul
DNTP 2ul
5’AOX1 1ul
3’AOX1 1ul
酵母基因组 1ul
rTaq 1ul
20ul体系
94度1min
94度2min 55度 1min ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min

PCR2:DdH2O 14.2ul
10×buffer 2ul
dNTP(2.5mM) 2ul
上游引物VP5(25nmol/L) 0.5ul
下游引物VP3(25nmol/L) 0.5ul
质粒 0.5ul
rTaq 0.3ul
20ul体系

94度1min
94度5min 68度 45s ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min

结果见图:
925bp 2100bp

490bp

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