蛋白质组学

层析复性蛋白质

层析复性蛋白质

李明1 苏志国1 Janson Jan-Christer2 (1 生化工程国家重点实验室,中国科学院过程工程研究所,北京,100080 2 表面生物技术系,Uppsala 大学,Uppsala, 瑞典)

摘要在生物学和生物医学中,尤其在制药行业中,蛋白质的体外折叠复性是一个比较棘手的问题。最近利用层析方法复性成为研究的热点,本综述主要介绍层析复性方法的进展。

随着基因工程和生物技术的发展,蛋白质克隆与表达已经趋于成熟。在重组蛋白质生产的过程中,目标产物的异源表达容易形成不溶的聚集体,称为“包涵体”。大肠杆菌表达产生包涵体有以下优点[1,2]:

1) 以包涵体形式表达的蛋白质的浓度比较高,有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的30% [3];

2) 如果重组蛋白质以包涵体形式存在,由于包埋了酶攻击的位点,可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击;

3) 包涵体表达的蛋白质没有活性,细胞破碎和以后的纯化步骤,不用考虑蛋白质的失活问题;

4) 包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便,造价低,使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离;

5) 有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死,大量表达时会导致细胞的死亡,最终的细胞数量和产物相当低;而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达;

6) 对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易地进行在线的观测定性。

包涵体形式表达的蛋白质的主要问题是如何把无活性的蛋白质转变为有生物活性的可溶的形式[4]。高浓度的变性剂可以溶解包涵体,然后控制变性剂除去的速度,有时需要添加适当的氧化/还原试剂,蛋白质可以逐步折叠复性。通常使用的复性方法有以下几种[5]:

a) 稀释复性: 直接把溶解的蛋白质稀释入复性缓冲液中是最经常使用的方法。这种方法操作简单,适于小规模使用, 但是这种凡是需要极低的蛋白质浓度,以避免大量聚集体的形成。

b) 缓冲液置换复性:例如透析、渗滤或者凝胶过滤层析。透析[6]和渗滤[7]是使用超滤膜使变性剂和还原剂脱除出去以使蛋白质折叠复性。但是由于蛋白质可以结合到膜上而使这种复性方法受到限制,这也是最近凝胶过滤层析复性备受关注的原因。

c) 可逆的吸附复性:使蛋白质可逆的吸附在固相介质上,例如离子交换介质、金属螯合介质等,可以避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。目标蛋白上的His-tag [8] 和Cellulose-binding domain[9]在伸展的状态下仍旧保持结合的能力。

最近层析复性方法成为研究的热点,不仅可以降低聚集体的形成,还可以适用于大规模生产,同时对目标蛋白质有纯化作用。根据复性方式的不同,可以把层析复性方法分为三种[10]:

1) 基于缓冲液置换机理的凝胶过滤层析

2) 蛋白质可逆的直接吸附在介质上,随后除去变性剂诱导蛋白质复性

3) 把有助于蛋白质复性的小分子固定在固相介质上,然后蛋白质结合这些小分子,小分子起到辅助折叠的作用本篇综述主要讨论层析方法复性蛋白质的技术,并且着重讨论最近发展的梯度层析复性的进展。
吸附复性

由于影响蛋白质复性效率的一个重要的因素是蛋白质聚集体的形成,一个有效的降低蛋白质聚集体形成的方式是把变性的蛋白质吸附在固相介质上,这样当降低变性剂浓度,蛋白质逐步折叠时,由于各个蛋白质分子被吸附在介质上,折叠中间体之间形成聚集体的可能性会大大降低。

把蛋白质固定在固相介质上研究蛋白质的折叠的工作可能在1962 年就开始了,Epstein 等人[19]把胰蛋白酶和核糖核酸酶固定在羟甲基纤维素上研究蛋白质二硫键的还原情况。1975 年,Light 等人发现把糜蛋白酶原共价固定在琼脂糖可以获得50-70% 的复性收率[20,21]。随着新型的吸附介质的发展,各种类型的层析介质被用于蛋白质复性的研究上来。

最早把变性蛋白质可逆的吸附在离子交换层析(IEC) 介质上的工作是由Creighton 开始的

[22] 。首先IEC 层析柱被含有8M 脲的缓冲液平衡,然后8M 脲溶解的蛋白质进样吸附在层析柱上。当层析柱内脲浓度梯度降低时,蛋白质会自发的折叠复性,同时,折叠中的蛋白质仍旧吸附在层析介质上。最后,当变性剂被完全除去时,蛋白质也完成折叠,被随后的高盐缓冲液洗脱出来。Creighton 用此种方法成功的复性了三种以包涵体形式表达的蛋白质[23,24]。

IEC 过程除了可以温和的除去变性剂以使蛋白质复性以外,还可以使碱溶解的包涵体蛋白质复性[25] 。包涵体蛋白质溶解在0.01 M NaOH 、8 M urea 和 1% SDS 中,层析柱用20 mM Tris-HCl, pH 8.0 平衡上样,NaCl 浓度梯度洗脱,获得了“天然”状态的活性蛋白质。

在IEC 中,变性剂的浓度梯度并不能每次都获得高的活性回收,例如α乳白蛋白的收率只有10% 左右。原因可能是折叠的中间体很难从层析介质上洗脱出来。为了避免折叠中间体在层析介质上的堆积,我们发展了两种缓冲液系统的复性方法[26] 。溶解的蛋白质吸附在高浓度变性剂缓冲液平衡的层析柱上,梯度降低变性剂的浓度,同时梯度增加盐离子的浓度,这样可以使蛋白质自发折叠的同时,离开原先吸附的位点,向柱下端移动。移动的同时,蛋白质分子可以调节折叠的结构,到达一定的位点,由于盐离子浓度降低了,蛋白质又可以吸附在层析介质上。如此反复,使蛋白质在吸附、解吸附、再吸附的过程中,完成结构的重排。

另外需要考虑的因素是蛋白质的二硫键[27] 。一般情况下,缓冲液的pH 值离开蛋白质的等电点越远,聚集体形成的可能性越小[28] ;缓冲液的pH 值也会影响半胱氨酸附近的带电残基,从而影响蛋白质二硫键的形成[29] 。为了同时考虑到蛋白质结构的折叠以及二硫键的形成,特别是在大规模生产中难于同时兼顾到的这两个问题,我们设计了在IEC 过程中使用双梯度过程[30] 。在变性剂浓度梯度降低的同时,或者提高或者降低复性缓冲液中的pH 值,可以使含有二硫键的蛋白质的复性效率大大提高。在复性Fe-SOD 的过程中,双梯度离子交换层析方法显示了其优越性[31] 。

金属亲和层析(IMAC)是另外一种有效的纯化和复性蛋白质的层析方法。在高浓度变性剂存在的情况下,组氨酸尾仍旧具有吸附在金属亲和层析介质上的能力,所以可以在IMAC 上同时实现复性与纯化[32-35] 。如同Creighton 的IEC 过程,蛋白质吸附在IMAC 柱上后, 先逐步降低变性剂的浓度,使蛋白质折叠,然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗脱出来。对于TNF 蛋白,使用IMAC 获得了90% 的复性收率[36] 。

疏水相互作用色谱(HIC) 可以吸附变性蛋白质的疏水位点,降低变性剂的浓度,蛋白质可以折叠复性。对于HIC 对蛋白质的复性作用进行充分研究的是西北大学的耿信笃等人

[37] 。他们认为色谱固定相的疏水表面与蛋白质的疏水残基发生吸附,流动相的变化,促使蛋白质发生折叠。在此基础上,他们对人干扰素γ进行了有效地复性。

但是,如果色谱固定相表面与蛋白质的作用力相当强的话,则如同反相胶团的机制,蛋白质比较难于折叠复性。因为蛋白质的折叠过程是蛋白质的疏水残基逐渐内卷并被亲水残基包埋的过程,如果蛋白质的大部分疏水残基被结合的话,可能阻止了蛋白质的折叠过程,此种方法可能对一些小分子的疏水性蛋白质折叠比较有利。并且,变性的蛋白质溶解度下降,在高盐的情况下,溶解度降低更多,进入到柱子中的蛋白质可能发生沉淀,从而堵塞柱子。蛋白质发生折叠复性之前必须有一个溶解的过程,高盐浓度下蛋白质的活性也受到抑制。

可逆的吸附层析除了可以提高复性效率,还可以使传统方法难于复性的蛋白质成功折叠。胃蛋白酶难于在体外复性,甚至以为不可能在体外复性,但是Kurimoto 等人[38]发现吸附在琼脂糖上的胃蛋白酶可以在pH3-5 的条件下复性,并且复性时间特别长,最后他们在pH5 的条件下获得了60% 的复性效率。这是第一次体外成功复性胃蛋白酶的报道。

吸附辅助复性

与蛋白质直接可逆的吸附在层析介质上,以降低聚集体形成的机制不同,一些有助于蛋白质折叠的小分子,如分子伴侣、抗体,可以共价结合在层析介质上,然后使蛋白质进入到层析柱中复性。

体内蛋白质折叠与聚集体的竞争被伴侣分子和折叠酶所调控[39] 。例如,大肠杆菌的伴侣分子GroEL 和GroES 可以结合到新合成的或者未折叠的或者折叠的中间体,以避免非特异性结合形成聚集体,由此推断,这些折叠伴侣分子或者折叠酶同样也会帮助蛋白质体外折叠[40] 。由于这些伴侣分子和折叠酶是蛋白质分子,当目标蛋白质折叠完成以后,这些蛋白质分子需要除去,由此会增加工艺的步骤。但是,当把GroEL 固定在琼脂糖上可以复性溶菌酶[41] ,同样的,其他的有助于折叠的小分子固定化也会帮助蛋白质体外折叠[42] 。三种伴侣分子系统:GroEL( 抑制蛋白质聚集)、DsbA (帮助二硫键的交换)、和脯氨酸异构酶固定在琼脂糖上,可以帮助含有二硫键的蝎毒素Cn5 折叠[43]。对比在溶液中的伴侣分子系统,这些分子可以重复利用,从而降低了折叠的成本。

尽管没有理论基础,但是已经证明环糊精有助于蛋白质的体外折叠。环糊精分子量比较小,可以容易的与蛋白质的折叠中间体的疏水位点以弱相互作用力形成复合体[44], 从而降低聚集体的形成;并且,当蛋白质进一步折叠,降低了表面的疏水性时,这些结合的环糊精小分子可以逐步的离开。线性的糊精同样可以抑制聚集体的形成,有助于蛋白质的折叠[45] 。

由此不难看出,如果把环糊精或者糊精共价固定在固相介质上,可以帮助经过介质的蛋白质折叠。

脂双层膜可以根据蛋白质分子表面的不同的疏水性能,选择性的结合不同的蛋白质;脂质体可以识别蛋白质折叠的中间体,如同分子伴侣抑制蛋白质聚集体的形成[46] 。同样,固定化脂质体的层析可以提高蛋白质折叠收率,并能部分纯化蛋白质[47]; 折叠后的蛋白质溶液不需要分离脂质体。

已经知道在复性缓冲液中加入高浓度的L-精氨酸可以显著的提高正确折叠的蛋白质的收率。L-精氨酸可以提高折叠中间体的溶解性[48]或者不利于聚集体的形成[49],那么,共价结合L-精氨酸在层析介质上同样应该能够提高蛋白质的折叠效率,并且可以重复利用。

在溶液中复性牛碳酸苷酶B 时发现, 聚已二醇(PEG) 加入到复性缓冲液中可以与折叠的中间体形成复合物,这种复合物不会结合,从而抑制聚集体的形成[50] 。虽然这种结合能力很弱,如果除去这些双性的小分子需要增加纯化步骤。而在弱的疏水层析过程中,在介质上共价结合PEG 可以显著的提高蛋白质的折叠效率[51].

抗体分子可以结合折叠中的抗原分子从而提高抗原分子的折叠效率,此时抗体分子类似一种模板,折叠中的抗原分子可以识别,并且有助于其正确折叠。已经发现,只有抗体的识别位点与折叠中的抗原分子位点相对应时,抗体分子才具有帮助折叠的功能[52] 。当这种抗体分子在一定变性剂浓度下,仍旧保持与抗原识别位点结合能力的话,固定化的抗体分子可以帮助抗原分子的折叠,这尤其对工业生产中尤为重要。

一些情况下,一些小蛋白质分子,或者某些目标蛋白分子的片段加入到复性缓冲液中,可以作为折叠辅助成分有助于蛋白质的折叠。例如,碱性蛋白质加入复性缓冲液中可以提高碱性蛋白质折叠的效率,但是酸性蛋白质则降低碱性蛋白质折叠的效率[53] 。Soto 等人认为合成的可以识别目标蛋白质的构象的小分子片段可以降低非正常折叠结构的稳定性,从而纠正错误折叠的结构,有助于蛋白质的折叠[54] 。这些被称为合成的小分子伴侣的分子,可以识别蛋白质的一些构象,有利于或者不利于蛋白质的稳定[55] 。如果这些合成的小分子伴侣固定在层析介质上,同样可以有利于蛋白质的折叠。

过程集成

工业生产中,降低复性操作的步骤和试剂的使用量可以降低操作成本,并且进一步了解包涵体溶解方法,添加合适的添加剂同样可以提高蛋白质生产效率。同时,如果把复性操作

同其他的过程集成,可以显著降低试剂的消耗成本。所以,使用层析方法复性蛋白质,可以回收还原剂和变性剂,从而降低试剂的消耗。同时,蛋白质的聚集体可以进一步溶解,再次进入层析柱进行下一次的复性操作。

刚性的介质表面可能会妨碍折叠中的多肽的结构卷曲和重组,从而降低蛋白质折叠的收率。为了解决此类问题,在介质上连接伸展的柔韧性的基团可以避免或者降低这种不利的因素,例如,被称为“tentacle supports” [56] 的新型介质,为吸附在介质上的蛋白质提供了三维的空间位置,在蛋白质体外折叠中可能将会扮演重要角色。

层析方法复性蛋白质的优点除了可以提高蛋白质复性的效率之外,目标蛋白质可以获得在线的分离纯化。Cho 等人[57] 把大肠杆菌悬浮在高浓度变性剂缓冲液中,破碎后,把破碎液吸附到扩张床内的离子交换介质上。当缓慢的除去变性剂以后,这些吸附的蛋白质分子可以折叠复性。两种包涵体蛋白质hGH-GST 和rIFN-α-2a 可以获得比稀释复性高三倍的复性效率和纯度。这种扩张床式的层析复性方法,具有处理量大、蛋白质浓度高、可重复生产以及降低操作步骤等优点。

讨论

没有一种复性方法能够满足所有的蛋白质复性的需要,不同蛋白质要求的生理生化环境也不同,所以,对于不同的蛋白质需要设计不同的试验以寻求更好的复性手段。层析复性方法在一些包涵体蛋白质的复性过程中,显示了它的优越性:在层析复性过程中,可以容易的实现降低聚集体的形成、减少化学试剂的消耗、提供蛋白质折叠温和的环境等目的。当然,在层析复性过程中,在亲水的层析柱内越是接近蛋白质折叠的细胞内环境,蛋白质的折叠效果应该越理想。

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