蛋白质组学

『原创』『整理-问答方式』当磷酸化遇到 western blot

我提出这个话题是因为见到了很多人问到关于磷酸化的问题,我在此抛砖引玉,希望大家在这方面有心得的多谈一谈。看了觉得好可千万不要让它沉了。 :-P:-D:D:D

①如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?
答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

②做细胞信号传导,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?
答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。

③检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗?
答:可以。

④我想问您裂解细胞用三去污裂解法,还是用上样缓冲液?
答:用上样缓冲液,这样有几个好处,可以提取总蛋白,同时又可以让磷酸化酶失活。

⑤准备做大鼠脑子的Western Blot,蛋白质位于细胞核中,请问此蛋白质的提取液及操作方法是?每一步都必须要低温吗?这种蛋白质是磷酸化的蛋白质,操作时如何防止去磷酸化的发生?
答:可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白,可以加NaF防止去磷酸化。

⑥我要测两种抗体,一种为磷酸化的目的蛋白,一种为总的目的蛋白,不知道用什么方法strip最好,我用甘氨酸(PH2.9)漂洗15分钟,似乎没什么效果?
答:你可以加巯基乙醇(loading buffer 一样的浓度),56度, 30mins看看。

⑦ 磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等?
答:NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂,一般最好加。但是不加也可以,大部分时候是不用加的。我做的时候从未加过,都做出来了。

⑧需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量,但相互间干扰太大,怎么办?
答:将膜放入stripping buffer(SDS 2%,Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM,beta-巯基乙醇 100mM)中,50℃孵育30分钟,TTBS西三次,再重新加入一抗,进行另一种抗原的检测。

⑨一个分子的磷酸化修饰是否会使这个分子的分子量变大?如果我想要从组织中检测某一蛋白的磷酸化,怎么着手???
答:每修饰一处,分子量要变大80。直接通过SDS-PAGE检测磷酸化前后电泳迁移率变化,蛋白磷酸化后电泳迁移率变慢,可观察到,但与蛋白的性质有关,其被磷酸化的位点多少,前后分子量变化等有关。

⑩磷酸化的western与普通的western有什么不同,具体的操作步骤,注意事项?
答:蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应,所以取样品的过程要迅速,样品要新鲜,还有就是最好是新鲜配制的裂解液,裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,okadaic acid 是磷酸酶抑制剂。再者,还要看检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸,如果是酪氨酸还要加1um的sodium vanidate 即原钒酸钠 。okadaic acid 中文名为岗田酸,其为磷酸酶抑制剂。其价格不菲,如果考虑价格因素,可以用NaF,NaVO3以及B-甘油磷酸钠来代替。 封闭专用脱脂奶粉:为封闭Immunoblot膜上的蛋白结合位点定制。经过特别工艺去除脂肪,并灭活蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性。蛋白激酶的灭活有利于保护野生型蛋白底物处于非磷酸化状态;灭活蛋白磷酸酶可使已磷酸化蛋白免于去磷酸酶的去磷酸化,因而能维护蛋白的磷酸化状态,为Western Blot提供最佳封闭效果的同时不影响蛋白底物的性质,特别适合蛋白磷酸化和去磷酸化研究。不含添加剂,在室温下能快速溶解于TBS或PBS缓冲液中。

(11)用偏凡酸钠可以代替原凡酸钠?
答:二者不是一个东西,原凡酸钠又名正泛酸钠。可以抑制磷酸酶。从而保护蛋白的磷酸化位点。

(12)关于抗体
答:根据多年经验,不建议买××公司(尤其国内)分装的小包装抗体,省一些钱但经常不能用,目前除了2抗买国产的,一抗倾向于sigma(santa品种很多但不好用;其它R&D等等吧,效价不一定比sigma高,从时间、精力、资金等多方面考虑,最佳性价比是sigma的),磷酸化抗体最专业的是cell signalling。一般抗体的价格都在2000-3000之间。

(13)在stripping后还可以再检测磷酸化蛋白么?
答:可以,但是处理过程要切切注意低温。磷酸化最好放在第一次,除非特别需要

(14)如果要检测某一组织的磷酸化蛋白激酶水平,取材后一定要马上用干冰转移至-80度冰箱保存吗?
答:尽量, 但也不用这麽样, 你要看你的蛋白的性质。

先就这么多吧,有些是整理了一些园子里的东西,请各位作者见谅:D8D

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