蛋白质组学

蛋白质磷酸化的检测方法 欢迎大家授业解惑

我总结了一下:
具体有几类,但有些问题想请教大家。
1,  由于很多蛋白有各自的特性,我们遇到需要检测磷酸化的时候,可以检索文献资料,看看是否有可靠的方法可选择。
2,  一些蛋白磷酸化后其生物学功能会发生改变,可以通过检测生物学功能的变化来间接检测其磷酸化是否发生。
但是这个办法操作性很差,因为需要提取蛋白并且需要保证其活性,同时也需要一定量才可以达到可以检测到活性变化的水平。
3,  此外有非特异性的丝,酪氨酸磷酸化抗体,具体情形我不清楚,希望用的的兄弟仔细说说。不过我估计应该是单抗特异性检测某个氨基酸的磷酸化。所以只要有磷酸化就可以发生免疫反应。搜索论坛发现一个同志已经做了一定阐述,希望可以获得进一步解答。
“如果没有针对该蛋白的酪氨酸磷酸化抗体,那需要先用该蛋白的抗体进行共沉淀,然后用非特异性的酪氨酸磷酸化抗体进行WB的检测;另外也有将纯化细胞内磷酸化蛋白柱子,可以先将细胞内的磷酸化蛋白纯化下来,然后用该蛋白的抗体进行WB的检测;”

先将蛋白共沉淀是不是为了分离这个蛋白,因为其他蛋白抽提方法都是分离总的蛋白,而非特异性的丝,酪氨酸磷酸化抗体只是识别单氨基酸是否磷酸化,而总蛋白中其他所有的丝,酪氨酸磷酸化蛋白都会被探测到的缘故。
先用柱子纯化磷酸化总蛋白,再用特殊抗体检测实际上是分离先后顺序不同而已。

4,  如果有可以特异识别目的蛋白的磷酸化的抗体,那么直接western blot 就可以检测了。
5,  还有蛋白质磷酸化后电泳速率改变,磷酸化后减慢。这也是可以分辨磷酸化状态的,此时只需要一个特异性抗体就行了是不是??? 但是我看大家的意思这个抗体还必须是第4段我提到的那个特殊抗体。 但是既然电泳速度改变,我认为一般的抗体也行啊。第4段那个方法事实上应该western blot只有一条带才对。因为一种磷酸化方式对应一条带,一个特殊抗体。
我看一个论文,他western blot用的什么抗体没有说明,就说某个蛋白的多抗。然后结果有未磷酸化,p1类型磷酸化,p2类型磷酸化,p3类型磷酸化四个带,我估计利用电泳速率变化来分辨应该是一种普通的抗体就行,这个抗体不需要分辨是否磷酸化。磷酸化与否是通过电泳速率快慢完成的。
但是蛋白磷酸化是否一定速率变化的可以分辨是问题一,是否一定变慢没有特殊是问题二,我估计这个方法不是每个蛋白都适合,估计应用时需要文献的支持,人家可以做咱也可以,否则就可能要摸索了。
6,  其他还有检测底物的转肽来间接反映蛋白的酪氨酸磷酸化状态的,具体情况具体分析 ,这个我没有看懂,不知道是不是就是我说得第二点。

中华劳动卫生职业病杂志 2002年 12月 20卷 6期
附件如下,就是检测磷酸化的。 维普的浏览器打开

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