蛋白质组学

EMSA条件优化

将最近看到一篇较好的文章中的英文翻译并整理如下啦^_^,错误之处请批评指正:

一、EMSA反应影响因素:
1、  DNA探针:探针可以和目的蛋白相结合,但同时也可以被其它蛋白非特异性结合,因此在得到特异性条带时也会有非特异性结合条带、“smear”探针条带或样品滞留不出孔。
2、  目的蛋白:同理目的蛋白除对其特异性结合的探针结合外,与竞争性反应中的非特异性DNA探针也有不同亲和力的结合,从而可以出现特异性结合条带或者与其它蛋白非特异聚集。
因此要优化探针与目的蛋白的量,使其能够达到产生特异性条带的最大量,同时又将探针或目的蛋白与反映中其它物质非特异性结合减至最低。

二、DNA结合反应条件优化如下图:
在一支1.5ml EP管中加入如下成分,30度孵育30min,加入少量EMSA loading buffer。

1.  成分加样顺序:最主要是要注意DNA与蛋白只能在最后一步接触。DNA探针只能与非特异竞争性探针一起或在其之后加入。
2.  温度:一般均在30度,但有的蛋白如sp1,在20度较好。
3.  时间:一般孵育为10-30min,对于大部分蛋白,这个时间已可饱和。
4.  pH值:核提取物pH值应为6.5-8.5之间,最好为7.9。
5.  一价离子强度:一价阳离子浓度是决定特异性和非特异性复合物比例的重要因素。许多非特异性蛋白质-DNA反应是离子性的,因此可以被高盐浓度所抑制。但高盐亦可与DNA的磷酸骨架反应导致DNA复合物断裂。所以若使用核蛋白粗提物,盐离子浓度最好于50-100mM之间,也有些因结构较稳定可以耐受200mM。
6.  二价离子:最多为Mg2+,其优化浓度为0-10mM,试验时可用5mM尝试。它可以加速蛋白质与DNA的反应,其中包括结合和裂解,因此优化时最好尝试Mg2+(+)和Mg2+(-)两种情况。Zn2+或Cd2+等阳离子有时可以增加DNA-蛋白质之间的结合,也可以消除电泳缓冲液中的金属螯合剂的影响。
7.  非离子性去污剂如NP-40、TritonX100,或Tween可以减少蛋白聚集,从而减少smear条带及DNA探针滞留孔中的情况。一般使用0.1-0.2%NP-40。有时高浓度(1-2%)亦可用于增加结合。
8.  蛋白样品:在20ul反应提醒中应从2-20ug进行试验优化,找出最佳量,一般核抽提物含有2-4ug/ul。
9.  非特异竞争探针:此探针的种类和量都需要优化,从而才能得到敏感、特异的检测结果。

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