蛋白质组学

western荧光淬灭的解决办法

不记得是07还是08年我发过一个帖子,询问western淬灭的解决办法,至今,仍有站有私信我关于这个问题的解决办法。与其一个一个的回复,还是发个帖子,特别说明,帮助更多的朋友走出这个困扰。

从私信我的站友的数量上看,western淬灭的现象还是挺普遍的。解决的办法其实非常简单,也常常有人提及,只是我们对这个改进有时不敢相信,或者没有做到相应的程度。呵呵,不卖关子了,下面就对荧光淬灭的现象形成和解决办法做一个详细的解答。

我们可以搜索站内的帖子,应该有不少都有提到,淬灭是由于显色反应中的hrp酶量过多造成的,推荐的改进方法是,减少hrp的量,包括,减少蛋白的上样量,降低一抗浓度,降低二抗浓度这三个方法,总之就是减少hrp在膜上的结合量。可能有的人会问,我大量的抗体或者蛋白上样量都做不出来,减少反而能做出来,这怎么可能呢?呵呵,其实我们首先要弄清楚,在显色反应中谁是过量的问题,当然是底物,因为,亮度与hrp的量相关,hrp与目的蛋白的量相关,只有底物过量hrp的量才能清楚的反应目的蛋白的量(这里就不考虑定性实验了)。因此,hrp相对于底物必须是不足量的。其次,应该有很多站友都遇到过这样一个现象:就是曝光时,条带特别亮,可是压上一两次片子,条带就灭了,但是如果把这张膜再用TBST洗过夜,再去曝光,荧光反而能持续更长的时间,这就是由于洗涤,使原先一些结合不牢的二抗掉了下来,曝光时,hrp的量降低了,不会较快的消耗底物,所以,发光的时间就变长了。

了解了这个淬灭原理,我们再来说说如果避免淬灭,影响淬灭的原因有很多,我们来一一说明:
1.一抗:抗体本身的特异性决定了实验好不好做,有的时候好的抗体,比如内参抗体,不需要很多的技巧,就能做出很好的结果。如果遇到特异性不好的抗体,非特异的结合会造成背景很强,留在膜上的hrp很多,所以也会引起淬灭,而抗体本来特异性就差,如果再减少蛋白上样量那就更做不出来了,所以,这种情况没有什么办法,就是多洗,增加洗涤的次数,我在实验室里,经常洗10遍20遍,不要担心洗会影响特异的结合,特意的抗原抗体反应,用洗瓶使劲冲都下不来,不特意的就会在冲洗的过程中,掉下来。
2. 转膜:与一抗特异性差类似的现象就是出现在转膜的过程中,就是转膜条件不合适造成的膜上蛋白量降低,有时候这种情况即使较好的抗体也会出现淬灭的现象,所以非常重要的是根据蛋白的大小选择gel的浓度,根据gel的浓度和蛋白的大小选择转膜的条件,可以适当的摸索一下转膜的条件,保证目的蛋白在膜上有较多的量。
3. 二抗:二抗即使是国产的也能有较好的效果,以前我们实验室用的最差的二抗是中杉金桥买一抗时赠送的二抗,出现过淬灭的问题,当时是担心抗体不好,所以都是1::1000左右稀释,就淬灭的特别厉害,底片一压上去就灭了,后来把二抗浓度降到1:10000到1:20000,效果非常好都没有出现过淬灭的现象了。

这个经验完全验证了我上面说的淬灭的原理,所以站友们,请相信我,降抗体浓度和孵育时间(特别是二抗)+使劲洗(可以适当增加tween-20的浓度),一定可以解决荧光淬灭的问题。还有就是不同的一抗都有不同的脾气秉性,做得多了,也就能慢慢的就能感受到自己的问题出现在哪里,适时的调整抗体的孵育条件,一定可以做出很漂亮的带的。

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