蛋白质组学

目标蛋白粗提方法 (虽然,但是很棒!)

狭义来讲,提取指制备物与细胞固体成分或其它结合成分的分离,由固相转入液相或从细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程,即分离前期被提取物从破碎的细胞中释放出来的过程。如果被提取物程固相或与固体结合,提取时由固相转入液相,常称为固液萃取;如果被提取物已经呈液相存在,提取时由一液相转入转入另一互不相溶的液相,这种方法称为液液萃取。
  广义来讲,提取又可称为抽提或萃取,贯穿在整个分离纯化过程中,如核酸制备中用氯仿或苯酚反复抽提除去蛋白质,分离DNA和RNA。
  提取的好坏受到多种因素的影响,包括:
  1)溶液 涉及到溶液中的保护成分、离子强度、PH值、温度、表面活性剂、变性剂(如尿素和盐酸胍)和粘稠度、溶液的更换;
  2)材料 包括材料本身固有的特性、材料的选择和处理;
  3)目的分子 目的分子的理化性质、存在方式和部位、含量;
  4)其它因素 搅拌、提取时间的长短。

  第一节 溶剂和溶解度

  一. 溶剂
  一些常用溶剂按其极性的大小,可依顺序大体排列如下:饱和烃类<全卤代烃类<不饱和烃类<醚类<未全卤代烃类~脂类<酮类<醇类。
  还可按形成氢键能力的大小,分为五类:
  1)能形成两个以上氢键的溶剂分子 如水,其两个氢原子和一个氧原子都可以形成氢键;
  2)能形成两个氢键的溶剂分子 既是氢键的供体又是氢键的受体,例如脂肪族的醇类;
  3)只作质子受体的溶剂分子 如脂肪族的醚类;
  4)只作质子供体的溶剂分子 如氯仿;
  5)不能形成氢键的烃类 如四氯化碳。
  1)和2)两类溶剂宜用于极性化合物的提取,3)和4)两类溶剂宜用于对溶液中弱极性或非极性化合物的提取。

  二.溶解度
  溶解度用于分离提纯有两个主要目的:1)选择一个对制备物溶解度大而对杂质溶解度小的溶剂,使制备物从组分中有选择地被孤立出来;2)或选择一个对制备物溶解度小而对杂质溶解度大的溶剂,使制备物从组分中沉淀或结晶出来。
  1. 物质溶解性质的一般规律可归纳为如下几点:
  1)极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性溶剂中;
  2)碱性物质易溶于酸性物质中,酸性物质易溶于碱性物质中;
  3)在极性溶液中,溶剂介电常数的减少伴随溶质溶解度的降低。
  总之,符合"相似相溶"原则。
  2. 影响物质溶解度的几个主要因素:
  1)离子强度
  A.有些物质,如DNA-蛋白,在高离子强度下溶解度增加。
  B.另一些物质,如绝大多数球蛋白和酶,在低离子强度下溶解性增加,称为盐溶;而在高离子强度下溶解度下降,直至出现沉淀,称为盐析。
  C.盐溶现象不仅在水溶液中发生,而且在低介电常数溶剂,如乙醇,也同样发生。故而稀盐液常用于大多数生化物质的提取。
  2)PH 值
  A.两性溶质分子,在等电点时易相互聚集,溶解度最低;而在远离等电点两侧的PH值时,溶解度增大。
  B.一些酸性或碱性小分子物质,在PH值很低时酸性物质呈现非解离分子状态,而碱性物质呈现阳离子状态;反之,酸性物质呈现阴离子状态,而碱性物质呈现非解离分子状态。离子状态的物质,不论是阳离子或阴离子都易溶于水,非离子的分子状态则易溶于有机溶剂。
  C.对蛋白质、酶、核酸等生物大分子来说,应避免过酸或过碱,一般控制在PH6-8范围。如单纯从溶解度考虑,等电点在酸性范围的蛋白或酶,可选用偏酸性溶液提取;等电点在碱性范围内,则选用偏酸性溶液提取,酸性条件还可解离目的蛋白与其它组分形成的离子键,并有利于细胞的溶解。
  3)温度
  A.温度的提高可增高物质的溶解度,减少溶液的粘度,有利于提取的进行。对于一些植物成分或某些小分子生化物质,提取温度常在50-70度。
  B.热提取法虽然提高提取效率,但所得提取液含杂质较多,不如冷提取法。对绝大部分生物大分子而言,提取温度一般控制在0~10度之间,以防止生物大分子的变性。
  4)去垢剂
去垢剂(表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质,一般具有乳化、分散、和增溶作用,可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型,中性去垢剂在蛋白提取钟应用的较多。
A.中性去垢剂 又称非离子表面活性剂,对蛋白质的变性作用影响较少,宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类,如PEG200;多元醇类表面活性剂,如山梨醇、司盘类和吐温类;聚氧乙烯脂肪醇醚,如苄泽类、平平加类;聚氧乙烯烷基苯酚醚,如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去;也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白,不必先除去去垢剂。
  B.阴离子去垢剂 常见的有十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠。前者可促进核蛋白的溶解,将核酸释放出来,并对核酸酶有一定抑制作用,常用于核酸的提取。
C.阳离子去垢剂 如洁尔灭、新洁尔灭、CTAB、CPC、ZEPH、克菌定、消毒净(TMPB)、杜灭芬等,消毒灭菌类居多。
  D.天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂,包括种类较为广泛,如各种树胶(阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶)、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆酸类、多糖类(如环糊精)等。
  E.两性表面活性剂 在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质,起泡性好,去污力也强;在酸性溶液中则呈现阳离子表面活性剂特征,其杀菌性很强。
  5)变性剂
  蛋白质变性剂的作用是破坏蛋白质的次级键,如氢键、盐键和疏水力,引起天然构象的解体;它们并不破坏共价键,如肽键和二硫键,故不涉及一级结构的改变。变性剂有溶解型和沉淀型两类,SDS、尿素和胍盐是有效的溶解型变性剂,而三氯乙酸、甲醇、和氯仿/异戊醇是有效的沉淀变性剂。一般而言,变性剂应用时常大大过量,破坏氢键的变性剂用量至少两倍于氨基酸的克分子数,如1克蛋白质可可结合1.4g。 SDS溶于水可达25%,对温度敏感,W/V贮存液最为方便。需要注意的是SDS的钾盐是不溶性的,所以SDS溶液中要避免混入钾盐。 尿素极易溶于水,可达10mol/L,在8mol/L以上要注意温度以防止沉淀。尿素在水中缓慢分解形成氨及高度活性的氰酸离子,故要防止高温。 三氯乙酸与过氯酸(TCA,PCA)都是极好的沉淀剂,能沉淀蛋白质和核酸,前者应用更为广泛。

  第二节 提取方法

  一.固液萃取
  在固液萃取中,提取物是由固相转为液相,或由细胞内转为细胞外,其提取效率与物质的扩散作用有关。
  为了增加扩散物质的量,也就是提高提取速度,常采用如下措施:
  1)提高材料的破碎程度,以增加扩散面积,减少扩散距离;
  2)进行搅拌,使已扩散的溶质迅速与溶剂混匀,以保持两项界面最大浓度差,或分多次提取,不断更换新鲜溶剂,以提高扩散速率;
  3)延长提取时间,提高提取温度,以及减少溶液粘度(如属大分子核酸干扰,加入少量鱼精蛋白或硫酸链霉素沉淀除去)等。
  实际上从破碎后的固体细胞提取所需组分,当细胞破碎程度及提取温度受到限制时,采用少量多次提取方法较为有利。

  二.液液萃取
液液萃取选用的溶剂必须与被抽提的溶液互不混合、且对被抽提的溶质有选择性的溶解能力。最常用的液液萃取溶剂为二相溶剂,水或水-醇为一相,与水互不相溶的各种碳氢化合物,如低级醚、酯、苯酚等,为另外一相。

  第三节 蛋白质和酶的提取分离

  一.蛋白质及其溶解性质
  蛋白质有多种分类方法:
  1) 按其功能 活性蛋白和非活性蛋白
  2) 按其结构 简单蛋白和结合蛋白
  3)按其溶解度 水溶性蛋白、醇溶蛋白、硬蛋白(不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂,遇强酸或强碱溶解)。一般来说,大部分蛋白可溶于水、稀酸、稀碱或稀盐溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂。

  二.蛋白质的一般提取方法
  1. 水溶液提取
  凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的蛋白质,一般可用稀盐或缓冲溶液进行提取,稀盐溶液和缓冲溶液,有利于稳定蛋白结构和增加蛋白质溶解度。
此时应考虑以下因素:
  1)提取液体积 加入量太少则提取不完全,加的过多则不利于浓缩,一般为原材料的3-6倍的体积,可一次或分次提取。
  2)盐浓度 一般在0.02-0.2M的范围内,常用的稀盐和缓冲液有0.02-0.05M磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、0.09-0.15M的氯化钠等。在某些情况下,也用到较高的盐浓度,如提取脱氧核糖蛋白及膜蛋白。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其它分子的静电结合,选用柠檬酸缓冲系统和焦磷酸缓冲液可获得较好效果。
  3)pH值 一般在被提取蛋白质的等电点的两侧,碱性蛋白用稀酸提取、酸性蛋白用稀碱提取。在某些情况下,为了破坏所分离的蛋白质与其他杂质的静电结合,选择偏酸(pH3-6)或偏碱(pH10-11),可以使离子键破坏而获得单一的蛋白成分。
  4)温度 提取时通常要求低温操作。只有对某些耐高温的蛋白质或酶(如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶及某些多肽激素。
  5)提取时常缓慢搅拌,以提高提取效率
  6)有时为了破坏蛋白质与其它物质的离子键或氢键的结合,加入少量的多价阴离子也有助于蛋白提纯。
  2. 有机溶剂提取
  一般和脂质结合比较牢靠或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,难溶于水、稀酸、稀盐和稀碱,常用有机溶剂提取。他们同时有亲脂性和亲水性,如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇等。其中正丁醇应用的较为广泛,能在水和脂分子间起着类似去污剂的桥梁作用,由于丁醇与蛋白质极性基团结合的竞争力比脂质大,所以可取代蛋白质与脂质的结合位置,使原来蛋白质在水中溶解度大大增加。
  有些蛋白和酶即能溶于稀酸、稀碱,又能溶于一定比例的有机溶剂。在这样的情况下,采用稀的有机溶剂提取可防止水解酶的破坏,并兼容除杂和提高提取效果的作用,现举例说明:
胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液,针对组织中共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性,可采用68%酒精溶液并用草酸调至PH2.5-3.0,这样便能在三方面抑制了糜蛋白酶的活性:
  1)68%酒精可以使糜蛋白酶暂时失活;
  2)草酸可以除去激活糜蛋白酶的金属离子钙;
  3)PH2.5-3.0是糜蛋白酶不适于作用的PH值。
而以上条件对胰岛素的溶解度和稳定性并没有影响,并可以除去一部分在稀酸及稀醇中不溶解的杂蛋白
垂体前叶ACTH常采用酸性70%丙酮,其设计原理是酸性可以促使ACTH的溶解,而70%浓度丙酮对ACTH的溶解度没有影响,却大幅度地降低其他杂蛋白的溶出,对提高分离纯化的效果极为明显。
3. 从细胞膜上提取水溶性的蛋白质和酶方法:
膜上的蛋白质或酶一般有两种存在方式:一种在膜表面上,与膜成分结合较松,经过充分粉碎细胞,在一定PH范围用稀盐溶液即可提取分离;一种是膜的内在成分之一,或与膜结合十分紧密,提取十分困难,需用超声波、去污剂、或其他比较强烈的化学处理,一般常用方法有如下几种:
1)浓盐或尿素等溶液提取 如NaClO4、尿素、盐酸胍等。当以上溶液浓度达到2M时,可抽去27%以上的膜蛋白,但这样的条件易引起蛋白质和酶的变性。
2)碱溶液提取 在PH8-11范围内,某些膜蛋白随着PH值的提高而溶解度大大增加,但碱提取法也容易引起蛋白酶和酶的失活,应用上不广。
3)加入金属螯合剂 蛋白质通过金属离子与膜成分结合时,加入金属螯合剂如EDTA可使蛋白质释放出来。
4)有机溶剂提取 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁醇是抽提膜上结合或内在脂蛋白最常用也最为有效的方法。如正丁醇可在广泛的PH值(3-10)温度范围内(-2- +40)内使用。
5) 去垢剂处理 用去垢剂分离膜蛋白时,要考虑两点要素,去垢剂的溶解能力和去垢剂的温和性。强阴离子去垢剂,如SDS,一般具有很好的溶解性能,但温和性不够理想,容易引起蛋白质变性;弱离子型或非离子型去垢剂对蛋白变性影响较小,但溶解能力较差。根据报道,Triton 100用于提取ADP/ATP载体蛋白时,由于作用较为温和,故所得蛋白活性要高于使用其他去污剂。 去垢剂的溶解能力与溶液的离子强度有关,一般说两者呈现正比关系。

   第四节 提取时的保护性措施

  提取一些具有生理活性的物质时,除了考虑被提取物溶解度外,还应考虑被提取物活性的保护。对于一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸来说,主要措施有如下几点;
1.采用缓冲系统 防止提取过程中某些酸碱基团的解离,造成溶液中PH值变化幅度过大,导致某些活性物质的变性、或由于PH变化影响提取的效果。在生化制备中,提取中常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等。
  [缓冲液] 分为非-双性离子缓冲化合物类和双性离子缓冲化合物类。前者包括HCl-KCl、甘氨酸-HCl、乌头酸盐-NaOH、柠檬酸盐-磷酸盐、柠檬酸盐-NAOH、醋酸盐、琥珀酸盐、顺丁烯二酸盐-NAOH、磷酸盐、TRIS-HCL、硼酸-硼砂、甘氨酸-NAOH、碳酸盐-碳酸氢盐等,存在反应性和缓冲能力有限等缺点。双性离子缓冲液虽然具有很多优点,但依然存在反应性与不适应性的问题,如HEPEs是氨基丁酸的拮抗性(反应性)、不适应于所有的组织培养(不适应性)。
  2.加入保护剂 防止某些生物活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏。如最常见的巯基,是许多活性物质和酶催化的活性基团,极易被氧化,故提取时常加入一些还原剂。一些易受重金属离子抑制生理活性的物质,加入某些金属螯合剂,把有害金属离子螯和掉,而保持被提取物的活性。 [螯合剂和巯基试剂] 巯基试剂在生化反应中有两个用途,一是防止蛋白质或酶等分子中的SH-基氧化成S-S,二是某些酶反应中维持体系的还原环境。经常应用的巯基试剂有二硫丁醇类化合物(如二硫苏糖醇DTT、二硫赤酰糖醇DTE)和2-巯基乙醇,谷胱甘肽也经常应用。一般来说二硫丁醇类是常选用的巯基试剂,不仅是因为挥发性低,难闻的气味较少,而且氧化电位低,比2-巯基乙醇浓度低很多的情况下,可以使其他二硫化合物完全还原。螯合剂用于控制反应中金属离子浓度或去除金属离子,常用的螯合剂有EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸等。
  3.抑制水解酶的破坏 根据不同水解酶的性质采用不同方法。如需要金属离子激活的水解酶,常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液除去溶液中的某些金属离子,使酶的活性受到抑制;对热不稳定的水解酶,可以用热提取法使之失去作用;或选用PH范围,使酶活性最低;还可针对性地加入某些抑制剂,以抑制水解酶的活性,但此类方法在蛋白提取中应用较少。
  4.其它一些特殊要求的保护措施 除避免紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等情况外,有些蛋白质在提取时还有特殊要求,如固氮酶钼-铁蛋白,必须在无氧条件下进行。

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