蛋白质组学

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觉得是非常实用的的文章,不是泛泛而谈,详细到连如何带手套都包括在内。

考马斯亮蓝染色双向电泳凝胶胶内酶切方法的改进

廖翔1 应天翼1 王恒樑1 王杰2 魏开华2 黄留玉1 黄培堂1
(1、军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071;2国家生物医学分析中心,北京 100085)

1.2 胶内酶解制备样品
用剪刀将200μl Eppendorf 吸头尖端剪掉约1cm,孔的直径约为1mm,用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点,再转入200μl离心管中。每管加入50μl脱色液(50%乙腈,25mmol/L 碳酸氢铵),室温放置30分钟,吸去脱色液,重复以上步骤脱色至胶块无色通明。抽真空离心干燥(Savant, Speed Vac Concentrator)30分钟左右至白色颗粒状,加入2μl (浓度为10ng /μl)溶于20mM碳酸氢铵的胰蛋白酶(Roche公司,测序级)4℃吸胀1小时,吸去多余的酶液,将管子倒置,37℃空气浴过夜。每块胶加入8μl 5%三氟乙酸(ACROS公司),37℃ 1小时,将液体吸净转移至一干净的离心管中,每个蛋白质胶块再加入8μl 2.5%三氟乙酸/50%乙腈,30℃ 1小时,吸出液体与前一次的提取液合并,抽真空离心干燥。抽干的样品可于4℃放置一个月,也可用2μl 0.5%三氟乙酸充分溶解肽段立即进行质谱鉴定。

3 讨论
3.1 切胶、脱色
传统的从双向电泳凝胶切取蛋白质点的方法是使用刀片,先切取胶块再切碎。操作刀片费时费力又很难做到精确,胶块的大小难于掌握,特别是在蛋白质点密集处几乎无法下手,而且如果刀片清洗不彻底容易造成污染。使用一次性的吸头则不存在这些问题。吸头是锥形的,通过在不同位置修剪可以随意调整孔径大小;用吸头切胶每个点的操作时间不到1分钟,省时省力且很少有偏差。从我们的实验结果看,肉眼能辨认的胶点取直径1 mm的胶块其蛋白质含量完全可以满足质谱鉴定的需要。为了整个程序的稳定性与重复性,建议统一吸头孔径不要让胶块有大有小,量大的点多取无益切下中央一小块就够了。为了便于操作,凝胶最好是放在干净的玻璃板上;当凝胶的操作时间过长,容易失水变干变脆,可以用纯水淋洗保持湿润。有文献报道将凝胶干燥后可长期保存不影响质谱鉴定,但我们没有试验过。为保证样品质量,建议尽量从新鲜的电泳凝胶上取点鉴定。
3.2 酶解
酶解是整个样品制备过程的核心所在,这一步主要做到两点:一是产生的肽段质量尽量落在适宜质谱检测的分子量范围内;二是尽量减少自切峰。酶解的把握关键在于缓冲体系与酶量及酶切时间。胰酶是一种丝氨酸蛋白酶,在pH 7.5-9特异性切断赖氨酸与精氨酸C端肽键,一般是以低浓度的碳酸氢铵(20-100mmol/L)[2,3,4]作为缓冲体系。在37℃十几个小时温育过程中水分的蒸发导致缓冲体系的变化是个大问题。一般的解决方法是加入过量不含胰酶的碳酸氢铵覆盖胶块,但这样会导致最后的样品中盐分过高,从而干扰肽段的出峰;而且蒸发本身并未得到解决。我们的办法是改变温育的方式,由常用的水浴改为空气浴,并且将管子倒置(此时胶块吸附在管底而不致于落下)。这样一来由于管子各面均匀受热减少了蒸发,二来即使有少量的水蒸汽也会重新凝在胶块上被吸收(此时胶在上面,而水汽是往上飘的)。由于酶的过量容易造成自切峰过强从而压制了有效的肽段峰,所以酶液体积一般以胶块充分吸胀为宜。酶切时间除了要考虑胰酶自切的问题,主要是把握好蛋白质酶切程度:酶切不足容易造成大肽段多,酶切过度则小肽段过多,这两点都不利于质谱检测。以我们这个操作程序的样品量与胰酶用量,酶切时间掌握在10至12小时为宜。
3.3 肽段的提取
这一步没有需要特别考虑的步骤。需特别注意的是质谱点样前溶解已抽干的样品时,在满足点样体积的前提下溶剂体积要尽量小,且应用吸头反复淋洗管壁以充分洗脱管壁上沾染的肽段;样品相对纯度与浓度越高质谱效果越好。提取液的体积可以随胶块体积调整,但如果体积过大则所占管底面积相应增加,抽干后肽段重新溶解时可能不够彻底而造成损失。对于蛋白质含量非常低的胶点,可能需要合并多块凝胶的该蛋白质点进行样品处理以提高样品含量及浓度。

3.4 其它
质谱样品制备各步骤对时间的要求不需要很精确,但整个过程中要求尽量杜绝各种污染。最常见的是角蛋白的污染,其来源主要是手指或头发,所以要求全程带手套操作;如果是橡胶手套一定要先洗去表面滑石粉,否则带来更严重的污染。其次是各种实验室耗材的污染,应尽量使用优质吸头与离心管以避免PEG污染,因为PEG污染可以造成样品出峰困难或根本不出峰。至于化学试剂,更应该尽量用高纯度、高品质产品。
有些蛋白质(主要是小分子量蛋白质)由于酶切位点少或分布极不规则,很难得到好的肽指纹图谱,可以考虑换一个蛋白酶进行酶切或者做能对单个肽段进行部分测序的Q-TOF质谱。

4. 小结
该方法主要是改进了切胶的操作,使手动取点变得简单且精确,大大降低了工作量;再通过对酶切与提取各个步骤进行充分优化,提高样品的质量。我们多批次取点鉴定蛋白质的检出率都在80%左右,表明这个方法的重复性也是很好的。

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