蛋白质组学

原核表达的心得

最近2个月都在做原核表达,刚开始什么都不会,连SDS-PAGE都跑成模糊的一片,其中的辛酸只有自己知道,现在实验慢慢上正轨了,自己也积累了一些经验。很怀恋之前探索的那段时光,现在把我做蛋白表达的过程和一些问题写出来,希望能够帮助开始做蛋白表达的人少走一些弯路。

1、表达载体的构建

构建表达载体是比较简单的,不过也是需要对你的蛋白还有所用的载体有一个详细的认识,对于比较大的蛋白最好选用能够助溶的标签,但是也不是固定的,比如我的蛋白有65-70KD,我也用的也是HIS,上清也是有少量表达。最关键的我觉得是ORF框不要发生移码突变,比较保险的做法可以先做电子克隆预测,推荐accelrys gene,功能很强大,非常好用。转化我是分两步走的,连接产物先转化DH5α再提质粒转化BL21,虽然比较繁琐但是比较保险,一般不会出现什么问题。构建载体没有出现什么大问题,所以也没有什么经验跟你们探讨,我从引物合成到测序完成,边做边玩2周搞定。

2、原核表达

原核表达遇到的问题就很多了,最开始跑的图非常差,我都不好意思拿出来,所以说开始实验做得不好没有关系,没有人天生就会,都要靠后天慢慢学习。

现在开始正题,开始,图方便,晚上接菌(接的很少,5μl接到10ml中),第二天加1mM IPTG 37°诱导3小时,SDS-PAGE图如下:(3#和5#菌是我两个测序正确的单菌落,I是有加IPTG诱导)

实验组和对照组蛋白表达没有差异。
后来拿过夜的菌液去测OD,呵呵,2点多,果断重新接菌,我一般按照1:100(园子的以前的大神说的)取过夜的菌液加到新的LB-KANA培养基,一般摇个3小时,OD=0.8,再去跑SDS-PAGE,图如下:(我的目的蛋白是65KD,红色的marker是70KD)

有诱导和没有诱导蛋白表达差异很明显,信心十足往下做,这一次还是图方便,一般接菌时为了能快点让菌的OD达到0.8,我把转数提高到了220rpm,我比较懒,既然是已经调了220rpm了,诱导的时候也就索性还是220rpm,还是37°3h。这次我还顺便做了IPTG梯度,单位是mM,SDS-PAGE图如下:

结果很郁闷,之前虽然目的蛋白也是很少,但是至少还是和上面的条带差不多大,但是这次,小的可怜(红色箭头标出)0.2mM的IPTG还不足以诱导蛋白表达,但是IPTG的浓度对蛋白表达也没上面影响。

什么原因,什么原因呢,隐约记得上次蛋白量比较多好像是160rpm摇的,马上换转数,SDS-PAGE图如下:

蛋白大小又回到原来大小了,原来转数真的影响表达啊,没有加IPTG的菌体自身蛋白比较多,说明IPTG对菌体还是有影响的,IPTG的浓度真的没有多大关系,这次0.2mM的也诱导出来了。
蛋白怎么表达这么少呢,是不是诱导时间太少,我又做了6h诱导时间,结果目的蛋白没有多大变化,反而菌体蛋白增加了。那低温诱导过夜呢,试试看,我做了2个温度,16和25,均诱导过夜,160rpm,SDS-PAGE如下:

很开心,还是先验证是目的蛋白再往下做,本来想做质谱,偏偏实验室的质谱坏了,刚好在园里看到有我这个目的蛋白的鼠单抗,哈哈,老天对我真好,果断试用,WB图如下:

接下来看看蛋白在上清还是沉淀表达,我是按照分子克隆指南上面的做法,100ml菌液16度和25度(感觉上次16和25差不多,所以还是做2个温度)过夜诱导,加4ml的结合缓冲液后,加溶菌酶到终浓度为1mg/ml,4°摇床20min,加tritonX-100至终浓度为1%,4°摇床20min,5000g离心20min,沉淀和上清分别上样,图如下:

虽然上清只有一点,但是我已经很开心,今天时间比较晚,没有超声,明天超声后再去跑,感觉应该上清的目的蛋白会更多一点。等我图片出来马上跟大家分享哈。 这是超声20min后的图,目的蛋白明显多了,但是杂蛋白也多了,接下来去配过柱子的各种缓冲液了,祝自己好运吧

谢谢大家我支持,今天刚跑完的图片,其中过柱裂解液是菌体裂解后上清过柱后收集的液体,未过柱裂解液是菌体裂解后上清的液体(应该算阳性对照吧这个),看出来250mM处蛋白挺多的,这样应该就没有问题了吧,我这个是50ml菌液摇的,5ml裂解上清,上样为10μl,祝大家实验顺利哈。以后会用lc-ms研究这个蛋白和受体的作用,有什么新的进展我会更新的

版主cake2003留言:
图文并茂,感谢楼主奉献秘籍!

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