蛋白质组学

HRP标记抗体的方法

酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物,可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

  戊二醛二步法
  1. 原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

  2. 标记步骤:

  (1) 称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室温静置过夜。

  (2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟,收集棕色流出液。如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中,缓慢搅拌。

  (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。

  (4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3?小时。

  (5) 加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时。

  (6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时。

  (7) 3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

  (8) 将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。

  3. 结果判定:

  (1) 定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。

  (2) 定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定(光程1cm)。

  酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4

  IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62

         酶量(mg/ml)   IgG量(mg/ml)   酶量
  克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4
          40,000       160,000   IgG量

   (3) 本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有2~4%的酶与蛋白质结合。

  4. 试剂及器材:

  (1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸馏水至200ml。

  (2) 1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。

  (3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液:取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。

  (4) 0.2M赖氨酸溶液:称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。

  (5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。

  (6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。

  (7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG,MW2000)。

  (8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。

  (9) HRP(RZ>3.0)。

  (10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。

  (11) 搅拌器,分光光度计,离心机。

  (12) 透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。

 

  简易过碘酸钠法

  本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和Ig结合,99%的Ig与酶结合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法。

  1. 原理:经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。

  2. 标记步骤:

  (1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。

  (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟。

  (3) 将上述溶液装入透析袋中,对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜。

  (4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg IgG(抗体,或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时。

  (5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时。

  (6) 将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4 PBS透析,4℃过夜。

  其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。

  3. 结果判定:

  除标记物IgG量的计算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。

  IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

  4. 试剂及器材:

  (1) 0.1M NaIO4:称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂,批号830602)溶于蒸馏水10ml中。

  (2) 1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:

  0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml

  0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml

  加蒸馏水至2,000ml。

  (3) 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:

       Na2CO3 0.32克

       NaHCO3 0.586克

       加蒸馏水至50ml

  再用蒸馏水作20倍稀释,即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。

  (4) NaBH4溶液(4mg/ml):

  临用时称取NaBH44mg溶于1ml蒸馏水中。

  (5) 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。

  (三) 工作浓度的选择

  在免疫酶技术中,首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化,便可导致试验结果产生很大的波动。另外,由于浓度过高,可使非特异性反应增加,而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此,正式试验前必须准确滴定其工作浓度。

  酶标记抗体的滴定方法是:将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上,然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应,以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价,或称工作浓度。

  其步骤为:先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔内加0.1ml,4℃过夜,次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600……(根据据抗体的滴度而定),分别加入反应孔中,每个稀释度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分钟。以2M H2SO4 0.05ml终止反应。

  结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标,结合物浓度为横座标,绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右,且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度,即为该标记物的工作浓度。

  有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。

  要说明的是,本法为ELISA直接法,所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中,因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法),以达到最适的实验条件。

  (四) 注意事项

  1. 在具备高质量HRP的条件下,所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高,亲和力好,这是保证标记物效价高,免疫活性好的首要条件。

  2. 所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂,最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品,因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则,影响标记效果。

  3. 室温搅拌时须避光,室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前,须认真检查,防止漏液。

  4. 浓的标记物相当稳定,常加入30~40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1~2年,但稀释成1∶10,只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。

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