蛋白质组学

7cm/11cm/17cm IPG胶条等电聚焦

(一)第一向等电聚焦(用自制溶液)
1. 从冰箱中取 -20 ℃冷冻保存的水化上样缓冲液( I )(不含 DTT ,不含 Bio-Lyte )一小管( 1ml/ 管),置室温溶解。
2. 在小管中加入 0.01g DTT , Bio-Lyte 按照如下表格 1ml 的量加,充分混匀。

IPG
pH Range  Bio-Lyte Ampholyte(Stock)
Range Conc.(w/v)  Sample Solution Volume
Per 1ml per 5ml per 50ml
3-10  3-10  40%  5ul  25ul  250ul
4-7  4-6  40%  2.5ul  12.5ul  125ul
  5-7  40%  2.5ul  12.5ul  125ul
3-6  3-5  20%  5ul  25ul  250ul
  4-6  40%  2.5ul  12.5ul  125ul
5-8  5-8  40%  5ul  25ul  250ul
7-10  7-9  40%  2.5ul  12.5ul  125ul
  8-10  20%  5ul  25ul  250ul
3. 从小管中取出 400 m l 水化上样缓冲液,加入 100 m l 样品,充分混匀。其中水化缓冲液与样品的比例不得小于 4:1 。具体的上样体积如下表,

ReadyStrip TM IPG胶条的长度  上样体积
7 cm  125ul-250ul
11cm  185ul-370ul
17cm  300ul-600ul
其中蛋白质的上样量与染色相关。具体的蛋白质上样量如下表,

IPG 胶条的长度  分析型的上样量 (银或 SYPRO Ruby 染色)  制备型的上样量 (考马斯亮蓝染色)
7 cm  10-100ug 蛋白  200-500ug 蛋白
11cm  50-200ug 蛋白  250-1,000ug 蛋白
17cm  100-300ug 蛋白  1-3mg 蛋白
4. 从冰箱取 -20 ℃冷冻保存的 IPG 预制胶条,于室温放置 10 分钟。
5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各 1cm 左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制 IPG 胶条上的保护层。
7. 分清胶条的正负极,轻轻地将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有 + )对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶 液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。
8. 在每根胶条上覆盖矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

IPG 胶条的长度  矿物油体积
7 cm  1 ml
11cm  2 ml
17cm  3 ml
9. 对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序 (以下程序为推荐程序,不同样品需要根据实际情况进行实验条件优化) 。
7cm 胶条
水化 12 小时( 17 ℃) 被动水化
S1 250V 慢速 30 分钟 除盐
S2 1000V 快速 60 分钟 除盐
S3 4000V 线性 3 小时 升压
S4 4000V 快速 24,000 伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
1) 选择所放置的胶条数。
2) 设置每根胶条的极限电流。( 30-50 m A/ 根)
3) 设置等电聚焦时的温度。( 17 ℃)
11cm 胶条
水化 12 小时( 17 ℃) 被动水化
S1 250V 慢速 30 分钟 除盐
S2 1000V 快速 60 分钟 除盐
S3 8000V 线性 4 小时 升压
S4 8000V 快速 40,000 伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
1) 选择所放置的胶条数。
2) 设置每根胶条的极限电流。( 50 m A/ 根)
3) 设置等电聚焦时的温度。( 17 ℃)
17cm 胶条
水化 12 小时( 17 ℃) 被动水化
S1 250V 慢速 30 分钟 除盐
S2 1000V 快速 2 小时 除盐
S3 10000V 线性 5 小时 升压
S4 10000V 快速 60,000 伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
1) 选择所放置的胶条数。
2) 设置每根胶条的极限电流。( 50-70 m A/ 根)
3) 设置等电聚焦时的温度。( 17 ℃)
10. 聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE 电泳,否则将胶条置于样品水化盘中, -20 ℃冰箱保存 1 到 2 天。

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