蛋白质组学

双向电泳的操作流程—个人经验整理

双向电泳
实验前一天
将所需的烧杯,试瓶,玻棒,量筒等泡酸.并向准备间要求大量的双蒸水.
第一天,准备试剂.
1.  水化液

Reagent   Quantity
urea  12g
Chaps  0.5g
Bromphendblue  50μl 1%solution
加双蒸水定容至25ml,1ml分装贮存于-20℃
1)  加双蒸水搅拌均匀,要求没有气泡和颗粒,否则会影响实验结果.尿素可以在27℃水浴中溶解,温度不可过高.
2)  DTT和IPGbuffer临用前加:1ml水化液+2.8mgDTT+5μl IPGbuffer
3)  IPGbuffer取决于所用的等点聚焦系统和IPG胶条的PH范围,即根据样品蛋白的PH值范围.
4)  水化液不可反复冻融.

2.  裂解液

Urea  19.2g
CHAPS  1.6g
IPGbuffer  800μl
以浓盐酸调PH至8.8,最后定容至40ml,分装贮存于-20℃
  将urea装入量筒中,一点点加水,不可加多,搅拌(可置于30℃水浴锅中),用PH试纸定PH值

3.平衡液

1.5MTris-cl,PH8.8(4×分离胶溶液)  6.7ml
Urea  72.07g
Glycerol  69ml
SDS  4.0g
Bromophenol blue  400μl 1%solution
加入双蒸水定容至200ml,分装贮存于-20℃.临用前加DTT或碘乙酰胺.

4.单体贮液

Acrylamide丙稀酰胺  60.0g
N,N’-methylenebisacrylamide(Bis-carylamide)  1.6g
双蒸水定容至200ml,用0.45微米的滤纸抽滤.4℃避光保存
5.4×分离胶溶液(1.5M Tris-cl PH8.8, 1000ml)

Tris-base   181.5g
双蒸水  750ml
浓HCL  调PH至8.8
最后加入双蒸水  定容至1000ml
用0.45微米的滤纸抽滤, 4℃保存.

6.电泳缓冲液

Tris base  15.1g
Glycine  72.1g
SDS  5.0g
加双蒸水至5000ml(若为大胶,最好配制6000ml,另外1000ml装瓶备用)
1.  室温保存
2.  一般情况下,电泳缓冲液可以用2次,荧光时则最好临用临配.
另外需准备10%APS(过硫酸胺),10%SDS,琼脂糖封顶液(1%低熔点琼脂糖溶液)

7.银染试剂

银染时,还需配制银染一套试剂,包括:
Solution (250ml per gel)  
固定液   25ml乙酸,100ml乙醇,125ml双蒸水
敏化液  75ml乙醇,0,.5gNa2S2O3,17gNaAc,双蒸水定容至250ml
银染液  0.625gAgNO3,双蒸水定容至250ml
显色液  6.25g Na2CO3,100μl甲醛(易变质,临用前加入),双蒸水定容至250ml
终止液  3.65Gedta,双蒸水定容至250ml
另外,在需要银染时,需要确认有足够大量的双蒸水.

第二天上午9:30分左右开始准备一向,操作约半小时,十点钟开启IEF.
1.  准备水化液: 1ml水化液+2.8mlDTT+5μl IPG Buffer
胶条长度  所需的水化液+样品的体积(μl)
7  125
24  450

2.蛋白质上样浓度不要超过10μg/μl,否则会造成蛋白质的聚集或沉淀,如果不确定,可以用裂解液稀释,增大上样体积;样品体积不能少于20μl.

3.建议蛋白上样量
IPG  银染(蛋白量)  考染
7cm  10-100μg  200-500μg
24cm  100-300μg  1-3mg
4.根据以上参考均匀上样,此时移液枪设置要稍大于水化液体积,均匀上样,前端上样稍多于后端,然后从-20℃取出IPG胶条,用镊子剥离保护膜,胶面朝下,将胶条放入槽中.利用胶条垂直上下移动调节水化液的分布,注意水化液一定要盖过于阳性端与阴性端,另外注意胶条下不可有气泡,若有少量气泡,可以用镊子轻轻赶出,切勿大力.
5.在胶条上覆盖约1ml的覆盖油,盖上盖子,放入仪器表面,槽必须与仪器平台上的白线垂直.
6.设置IPG仪器的参数.注意:室温一定要20℃左右,夏天必须开空调过夜,否则会损坏仪器.
晚上制作第二向SDS-PAGE胶:每一块胶(24cm胶)需要大约100ml,实际上2块胶可以只需要160ml.
第三天上午8点左右,IEF完成(尽量缩短S5的时间).进行第二向电泳.
早上7:30分到实验室,取出平衡液,称取DTT和碘乙酰胺(称取时避免角蛋白污染).
1.  每10ml平衡液加入100mgDTT(相当于平衡液1)
每10ml平衡液加入400mg碘乙酰胺(相当于平衡液2)
胶条长度  建议平衡液体积(ml/条)
7cm  5
24cm  15
2.  从槽中取出IPG胶条,放入平衡液1中平衡15min,再转移入平衡液2中平衡15min.注意始终不要碰到胶面
3.  用电泳液漂洗IPG胶条几秒钟
4.  IPG胶条的转移:将IPG胶条背面轻轻贴靠在长玻璃板上,用薄尺轻轻向下推,从侧面加入沸腾的琼脂糖(注意琼脂糖一定要刚刚出锅的仍在沸腾的,并且全程至少在沸水钟保温,因为琼脂糖极易凝结,所以一定要注意),然后再用薄尺轻轻迅速将胶条往下压,确保胶条上下均没有气泡(若有气泡会造成纵条纹,影响实验结果)
5.  电泳步骤:
1)  装上电泳玻板,确保玻板不漏水
2)  电泳槽中装满电泳缓冲液,并打开温控系统,调节温度为15℃
3)  电泳槽上方加注电泳液,使其没住玻板.盖上盖子
4)  设置参数
步骤  功率  时间
1  5w per gel  45min
2  20wper gel   6h
步骤一完成后机器会鸣响,按STOP,再按SET转入S2,start即可.(阿玛西亚公司)
5.电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角做记号.
6.染色
银染步骤(每块胶需要500ml,要保证所有的染色器皿绝对的干净
步骤  方法  时间
固定  固定液中  30min或者可以固定过夜
敏化  敏化液中  30min
漂洗  双蒸水  3次,每次5min
银染  银染液中  20min
漂洗  双蒸水  2次,每次1min
显色  显色液中  点出即止(凭经验与感觉)
终止  终止液中  10min
漂洗  双蒸水  3次,每次5min

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