蛋白质组学

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题目:Protein Identification by Mass Spectrometry: Issues to be Considered

出处:MCP Papers in Press. Published on November 6, 2003 as Manuscript R300012-MCP200

主要观点、创新点及学术、技术意义:
• 文章指出在大量运用蛋白质组技术鉴定蛋白的同时,要探究该技术的可靠性和显著性,急需制定一个运用该技术的规范标准。但由于蛋白质组技术路线和数据处理的多样性,很难快速建立一套硬性的规则。
• 利用肽段信息搜库鉴定蛋白时,结果强烈依赖于数据库和搜索引擎,并非绝对正确。肽段匹配的打分高低与很多参数有关,现在并没有统一的标准,各种算法和软件都不一样。文章建议对同一数据即采用不同的参数甚至不同的搜索引擎(如Mascot和Protein Prospector)进行鉴定搜索,以便相互补充映证。
• 未分离的基质可能会竞争吸收质子而影响肽段的离子化,或者肽段长度不在质谱可测范围内,都会造成相关肽段的无法检出。由于单酶切不易满足生成肽段的长度需要,现在一般都采用多酶切进行。
• 蛋白质肽段的检出受蛋白含量、抽提溶解效率、其它杂质、离子化模式以及质谱检测性能等诸多因素的影响。外来蛋白的污染会带来结果的假阳性、抽提中残留的盐和变性剂的会影响离子化效率。
• 基于肽段分析的蛋白质组鉴定方法分为三类:⑴基于理论酶解蛋白肽库的肽质量指纹图谱法,此法随着搜索数据库容量的急剧增加要求质谱提供更为精确的肽段质量数值,以及检出更多的肽段以提高匹配覆盖率;⑵来自于串联质谱具有合适匹配质量数的单肽段的碰撞诱导解离(CID)谱;⑶de novo策略。
• 串联质谱和CID已逐步取代PMF法而成为蛋白质鉴定的标准方法。对于《Molecular and Cellular Proteomics》杂志而言,仅仅基于PMF的蛋白质数据已不再接受,必须要有CID和串联质谱数据作为补充。
• 由于质谱鉴定是基于荷质比而非质量数,而低分辨率的质谱又无法测定肽段的带电荷数,在搜库时必须要假定肽段分别带1、2、3个电荷,有的搜索引擎甚至只假定其带一个电荷,因此可能会导致一些蛋白的鉴定结果谬误。高分辨率的质谱如QqTOF和FTMS能够测定肽段的带电荷数,因而能够消除这种不确定性带来的谬误。
• 质谱数据峰值自动转化软件对1.5kDa以下的具有良好信噪比的肽段峰能很准确地识别;2kDa以上的肽段则无法保证正确性,随着质量数增加特别是对于信噪比在阈值以下的峰的识别变得困难。
• 各种搜索引擎对质谱峰的搜索可能会得到一些非肽段匹配的峰,产生的原因可能是质谱本身的缺陷、蛋白的非特异性切割以及翻译后修饰或化学修饰造成。
• 胶上单点以及HPLC单组份峰可能会含有多个蛋白组份,但在用肽段信息搜库鉴定蛋白时我们都只会取一个蛋白。
• 对于高通量分析而言,回顾检查每个质谱鉴定结果是不现实的,但对于涉及到重要的和意外的发现而言就必须回溯到质谱原始数据进行检查。
• 质谱鉴定对匹配肽段数和蛋白覆盖率都有一定要求,随着蛋白数据库规模的日益增加,为避免含糊的或错误的结果出现,要求每条鉴定蛋白至少有一个肽段的CID质谱数据进行确证。
• 在一个样品中被鉴定出来而在另一个样品中没被鉴定出来的蛋白不能断言在后者中就没有,因为可能只是质谱没检测到而已。
• 文章还介绍了基于同位素标记的蛋白质定量技术,如ICAT技术等以及有关蛋白质翻译后化学修饰的测定技术。

不足之处:
这是一篇综述性质的介绍蛋白质组技术的文章,指出了蛋白质组学技术中需要注意和探讨的问题,也给出了蛋白质组技术的轮廓和概况,但都没有进行细致深入分析,可作为了解蛋白质组技术的入门文献。

其它体会
随着蛋白质组学研究和技术的快速发展,一些问题开始需要解决,一些标准也需要不断提升。比如PMF已经逐渐不能单独支持蛋白质组鉴定数据了,这些都要求我们随时跟进最新理论和技术的发展。

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