蛋白质组学

丨蛋白质体外瓜氨酸化

组蛋白的翻译后修饰过程对 DNA 转录,染色体功能以及维护细胞信号传导通路的正常运行具有重要的作用,瓜氨酸化是由称为蛋白质精氨酸脱亚胺酶(Protein Arginine Deiminases,PADs)的酶家族催化的许多关键组蛋白修饰手段之一。PADs 催化肽基精氨酸水解,在组蛋白上形成肽基瓜氨酸,调节与染色质结构相关的许多生化过程。

PAD 家族由钙依赖性同工酶 PAD1, 2, 3, 4 和 6 的五个成员组成。组蛋白瓜氨酸化是通过在组蛋白上转化精氨酸而影响染色体结构,导致氢键的减少和染色质解聚。很多重大研究已经将 PAD 确定为与癌症,自身免疫性疾病(类风湿性关节炎)和炎性疾病等许多人类疾病相关的药物发现项目的重要靶位。

实验材料

  • PAD Cocktail, Active(#P312-37C ): 10µl Active PAD Cocktail (包含 5 µg 总 PAD 蛋白)用 20ul PAD cocktail 稀释缓冲液进行稀释;

  • 抗-GST 抗体交联的 Agarose Beads: 可购买商品化产品或实验室自制;

  • PAD cocktail 稀释缓冲液:推荐配方为 0.1M tris-Cl, PH 7.4, 0.25 mM DTT, 10 mM CaCl2;

  • PAD 缓冲液:推荐配方为 0.1M tris-Cl, PH 7.4, 5 mM DTT, 10 mM CaCl2, 10 µg/µl aprotonin, 10 µg/µl leupeptin, 10 µg/µl pepstatin;

  • 4×Laemelli 样品缓冲液:推荐配方为 8% SDS,40% Glycerol,250 mM tris-Cl, PH 6.8,0.02% Bromophenol Blue, 8% β-mercaptoethanol;

  • 底物蛋白:根据各实验室的研究目的。

实验步骤

  1. 用 PAD cocktail 稀释缓冲液清洗和平衡 5µl 抗-GST 抗体交联的 Agarose Beads;

  2. 混合平衡后的 5µl 抗-GST 抗体交联的 Agarose Beads 和稀释好的共 30µl PAD Cocktail,在 4°C 孵育一个小时,并进行摇晃;

  3. 阴性对照,仅含有 PAD cocktail 稀释缓冲液;

  4. 孵育以后 Agarose Beads 用 PAD 缓冲液进行清洗;

  5. 清洗以后加入 10µl 底物蛋白和 100µl PAD 缓冲液,在 37°C 孵育 2 个小时,并进行摇晃;

  6. 离心,获取上清,上清中含有被瓜氨酸化的目的蛋白;

  7. 用 25µl 4×Laemelli 样品缓冲液终止反应;并将样品纯存于-80°C 以备进一步深入研究。

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