蛋白质组学

SPITC法修饰研究

各位大大, 最近小妹接到老板的任务, 要对SPITC法修饰研究进行实验, 在参考了大量的文献(15篇左右), 总结出了如下的流程, 并且进行了实验,我会把我的实验过程和结果贴出来, 希望大家能够共同分析并且提供小妹建议, 谢谢!!

以下是我试验的一个protocol,希望各位前辈能指点一下,谢谢!
我用BSA(国产)1mg 做样品,大致的流程是:先溶液酶解,然后C18 ZipTip固相SPITC衍生,洗脱冻干后打MALDI。具体步骤如下:
(一)溶液酶解:
8 M Urea 300ul(然后取30ul 进行下面步骤)
0.4% NP40 40ul
50mM NH4HCO3 111.6ul
0.5M DTT (现配) 2.0ul(56℃ 30min)
0.55M IAA(现配) 5.4ul(暗处 50min)
Trypsin(protein:trypsin=20:1) 37 ℃ 17h

17h后(第二天)发现水浴温度只有20℃,然后又37℃水浴了2h。取出后冻干。

(二)SPITC固相衍生
1.将C18 ZipTip缓慢吸入压出50%ACN/0.5%TFA 溶液数次,然后用0.1%TFA平衡
2.用200ul 0.1%TFA 将冻干样品复溶
3.用ZipTip 吸入压出复溶液大约10次左右
4.用0.1%TFA 冲洗
5.先用Tris-HCl Buffer(50mM/L PH 8.2)冲洗ZipTip,然后用ZipTip缓慢吸入2.55mg/ml SPITC (Tris-HCl Buffer配制),然后50℃ 水浴 1h
6.取出ZipTip,将多余试剂用0.1%TFA 冲洗干净,衍生后的样品用2.5ul 80%ACN/0.5%TFA 洗脱,冻干。

(三)MALDI 分析
1.将冻干的样品用1ul 0.1%TFA 复溶,加入1ul Matrix CCA(50%ACN/0.5%TFA的饱和液),混匀后点在样品板上,自然风干后打MALDI 。

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