蛋白质组学

基于钙调素与荧光蛋白融合的钙指示剂

1. 介绍

Ca2+ 浓度([ Ca2+ ] ) 变化涉及细胞过程,如细胞发育、分化和凋亡,在它们存在的时空环境中研究这些变化,可以深入地了解它们的生物学意义。合成染料( 如 Fura 和 Indo) 和发光蛋白(aequorin) 是研究 [Ca2+] 变化的常用工具,但是,多数合成染料迅速从细胞中流失,发光蛋白只有微弱的生物光且不能按比例显示[Ca2+] 的变化[ 1 ] 。相反,蛋白质 Ca2+ 传感器基于 Ca2+- 钙调素复合物和绿色荧光蛋白(起先被命名为钙变色子)克服了原先的这两个限制 ( 见注 1 )。本章我们描述包括钙变色子克隆、生化特性的鉴定和用数字荧光显微镜在单个细胞中成像的有关方法。在我们能够描述这些方法之前,必须理解荧光共振能量转移理论( FRET ; 见 4.1.1 ) 和对钙变色子的一般设计(见 4.1.2)。

1.1 FRET ( 荧光共振能量转移)的概念

FRET 是能量从给体荧光团到受体荧光团的转移。如果给体的发射谱与受体的激发谱严重重叠,这种转移就能够发生。这种能量转移在距离小于 80 A 时发生,并当两个荧光团靠得最近且取向平行时效率最高 [2,3] 。在设计钙变色子时,用 GFP 突变体作为两个伙伴荧光团:蓝绿色荧光蛋白作为给体,而黄色荧光蛋白作为受体(见图4.1 ; 参考文献 [4])。如果两个荧光团融合于不同的作用伙伴,分子间 FRET 可以用来探测蛋白质-蛋白质相互作用,而如果两个荧光团都融合到同一个蛋白质,分子内 FRET 可用来探测蛋白质剪切和构象变化 [3] 。

4.1.2 钙变色子的一般设计

使用分子内 FRET 的概念,钙变色子由夹在 CFP 和 YFP 之间的,前后融合的 CaM 的 N 端和 C 端结构域(分别记为 N-CaM 和 C-CaM ) 以及 CaM 识别序列(CRS) 组成 [5~7] 。CRS 的位置取决于它的结合取向,它或者放在 CaM 的 N 端、CaM 的 C 端,或者放在 N-CaM 和 C-CaM 之间 [ 见图 4.2  ( A ) 和注 2] 。在 Ca2+ 流入之后,CaM 结合到 CRS 上,引起构象变化,拉近 CFP 和 YFP,以增加 FRET 效率(见图4.2B)。已用 CFP-YFP 作 FRET 伙伴,制造出数种黄色的钙变色子(YC ) ,它们具有不同的 Ca2+ 亲和力、亚细胞定位和动态范围。本章提供的方法适用于所有已发表的用于 Ca2+ 成像的 YC,包括 YC2.1,它基于 CaM 结合到肌球蛋白轻链激酶 CRS 肽上的结构 ( MLCKp;参考文献 [7]);YC3.1,CaM 的单点突变 E104Q 降低了 Ca2+ 亲和力 [7]; YC2nu,以核为目标;YC6.1,基于改善了动态范围的,CaM 结合于 CaM 依赖激酶的激酶 CRS 肽(CKKp) 的结构。

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