蛋白质组学

利用核苷酸交换和剪切技术进行DNA碎裂和定向进化

1. 简介

近年来,化学、制药和食品加工等行业对“特性酶”(tailor-made  enzyme) 的需求越来越多。因为关于蛋白质的折叠、相互作用及如何稳定都并未完全研究清楚,到现在设计特性蛋白的途径仍然很复杂,并且要求耗时的多轮的设计和检验。采用重复进行突变、筛选和混编的进化步骤是获得目标特性的快速有效的手段,即使蛋白质结构 特征并不知晓。

多种方法可用于基因库的体外重组 [1] 。然而使用起来无一不是有缺陷或是有困难的。例如,发展的非常成熟的Stemmer 方法,通过优化酶切条件,使用 DNA 酶切割 DNA 获取所需大小的片段为进一步筛选大小合适的片段,通过琼脂糖凝胶电泳纯化酶切片段,再经内部引物延伸反应再组装,最后使用常规 PCR 扩增。然而,精确  控制 DNA 酶的酶切条件,如使用的酶及 DNA 的量、反应时间及温度等非常复杂,需要精细的优化摸索。其他的一些方法,如交错延伸程序(staggered   extension  process, StEP [ 4 ] ) 和随机引物法(randompriming )[ 5 ] 都受 DNA 组成的限制,并且由于缺少对重组及产生片段大小范围的控制而更为复杂难辨。因此欲使用上述的方法得到理想的结果都需要非常缜密的优化筛选。

不同于上述的方法,我们设计了一种高效、稳定的新方法。核苷酸交换和剪切技术 (NExT) 进行 DNA 混编是以 “交换核苷酸”的随机引入为基础。这些交换核苷酸在 DNA 序列中的出现和位置就指明了其产生的裂解部位,不需要进一步的调整。

应用 NExT 方法提高氯霉素乙酰转移酶 I ( CAT,可产生对氯霉素的抗性)截短突变体功能的研究对 NExT 方法进行了很好的发展和检验。在基因水平上对四组截短突变体独立开展定向进化实验。第一组 CAT 突变体库为 N 端截短 10 个氨基酸残基 ( CAT _Nd10 ),第二组突变体库为 C 端截短 9 个氨基酸残基(CAT _Cd9 ),第三组为 C 端截短 26 个氨基酸残基(CAT_ Cd26),第四组为 N 端和 C 端分别截短 10 个和 9 个氨基酸残基(CAT_ Nd10_Cd9 )。从易错 PCR ( error-prone  PCR) 多样化步骤中挑选 3~6 个产物作为检测库可以获得 NExT DNA 混编的详细数据 [6] 。

CAT_ Nd10 可以在含有 25 μg/ml 氯霉素的平板上生长,而 CAT_Cd9 则根本不生长。应用基于易错 PCR 和 NExT DNA 混编的完整定向进化策略提高二者的酶活性。通过优化,二个库均有若干克隆可在含有 400 μg/ml 氯霉素的平板上生长(未检测更高的浓度),证明了此种技术的有效性。同时,这种优化的方法也应用于根据我们的计算程序选出的含 30% dUTP 的 TEM-1 型 β-内酰胺酶(见 10.3.9)。这种裂解和再组装在实验的第一步就引入,只需确保足够的起始材料,节省了全部的前导和中间检测以及分析步骤(数据略去)。

本章概述了优化的 NExT 混编方法的全部步骤,从克隆开始(见 10.3.1),到尿苷酸交换 PCR ( 见 10.3.2 ),酶解反应及化学剪切(见 10.3.3 ),片段纯化(见 10.3.5),及最终的再组装和扩增(见 10.3.7)。对各步骤可调整的部分也分别进行了讨论。同时,给出了关于混编过程详细特性的分析方法(见 10.3.4 和 10.3.6 ),比较了不同方法的交换率、平均片段长度和变异率(见 10.3.8)。最后,介绍了一种预测 NExT 断裂参数和结果的计算程序(见 10.3.9 )。

NExT 方法基于预先确定的合理的 dUTP : dTTP 的比率,操作简单,因此非常适于短的基因片段和大的基因组合的混编。由于 NExT 混编方法的稳定和简便性,就算之前很少涉及这个领域的工作者也能应用此方法解决 DNA 和蛋白质水平上的生物化学领域的问题。

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